SfiI GGCC N N N N N GGCC
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 起
２）富含ＧＣ
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液 ，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后 ，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
七. 其它特异性的内切酶及其用途
1. λ末端酶（λ terminase）：
5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412
分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的 腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等， 但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。
2. Omega核酸酶（I-SceI）：
由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为
5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’
TATT
3. I-PpoI：来自于Physarum polycephalum
识别序列： CTCTCTTAA GGTAGC
表2 对甲基化敏感的限制性内切酶
限制酶
AvaⅡ BclⅠ ClaⅠ EcoRⅡ HphⅠ MboⅠ NruⅠ Sau96Ⅰ SauFⅠ StuⅠ TagⅠ XbaⅠ
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG
TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG GATCGA TCTAGATC
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶引入甲基，受其影响的 酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA， 可防止DNA的甲基化。
③ 酶切反应的温度
多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或 30℃ ，SfiI为50℃ 。
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是
５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制 酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。
AATT
4. 用途
遗传标记， 构建载体
八. 限制酶的用途
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切与完全酶切
附：IIS型限制酶的特点
1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不 具有对称结构。
2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位 点的一侧，1-- 20nt。 3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。 4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。 5. 均为单体，分子量为47—108 kD。
②酶用量过大，大于100U/微克DNA。
③低离子强度，小于25mmol/L。
④高pH，大于8.0。
⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。
⑥ Mn2+ 、 Cu2+ 、 Co2+ 、 Zn2+ 等 非 Mg2+ 的 二 价 离子的存在。
常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、 KpnI、PstI、SalI、HinfI等。
Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次 操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积 应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓 度超过5%时将会抑制酶的活性。
②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而 且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间， 减少酶的用量。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
M．HpaI C mCGG
HpaI C CGG 相同
2. E．coli 的dam、dcm甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制 修饰系统。
dam G mATC， dcm C mCA/TGG
3. 哺乳动物的甲基化酶
PstI
1, 2, 4, 7
PvuⅡ
2, 4
SalI
1, 2, 4, 7
ScaI
4 - 6, 8
SstⅡ
2, 4
XbaI
2, 4, 7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
BamHI + BglII A/G GATCT/C
不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种 末端可以相互连接。
五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
识别顺序是完全重叠还是边界重叠
如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—
dcm(CCA/TGG)
边界重叠 ClaI--dam；
Sau96I--dcm
2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序
为何种重叠
如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm—
BstNI
第二章 分子克隆 工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
六.限制酶的星反应（star activity）
1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低
2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）
3. 星反应的利用和避免
1.Ⅱ 限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 星 活 性 (star activity)
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm dam dam
*下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基 化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列
表1 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶
诱发星活性的条件a
识别序列
AvaI
1, 2, 4
BamHI
1 - 5Байду номын сангаас 8
G GATCN, G PuATCC
BstI
2, 4
BsuI
2, 4, 6
EcoRI
1, 2, 4 - 6
N AATTN
HaeⅢ
2, 4
HhaI
2, 4, 7
HindⅢ
6
HpaI
1, 2, 4
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG