第四讲乳酸菌及益生菌种类的功能及具有生物活性的次生代谢产物一、乳酸菌及益生菌1、定义及分类（1）乳酸菌（2）益生菌2．生物活性3．生长特性及应用、产品开发二、生物活性的次生代谢产物1、细菌素（1）定义及种类（2）特性Nisin是正常菌群中某些种类的乳酸乳球菌合成和分泌的一种对大多数G+菌有强大杀灭作用的细菌素。

Nisin对营养细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞质膜和磷脂化合物的合成受阻，从而导致细胞内物质外泄，甚至引起细胞裂解。

作为一种天然的生物性食品防腐剂和抗菌添加剂，Nisin已广泛应用于乳制品、罐头食品、高蛋白食品及饲料工业中。

添加400IU/g的产品储存11天，其含菌数比对照组低4个对数期，产品的感官可接受性较高。

Nisin对乳酸菌株的影响也较大，如控制适宜的添加量(一般在5-100mg/kg)，能对某些乳酸菌株有明显的抑制作用，造成菌株的活力下降、产酸受抑、生长不良，但乳酸菌总数变化不大。

nisin的研究现状乳链菌肽是由乳酸乳球菌产生的由基因编码的多肽抗生素，含有34个氨基酸残基，分子中含有5种稀有氨基酸，即氨基丁酸（ABA）、脱氢丙氨酸(DHA)、β-甲基脱氢丙氨酸（DHB）、羊毛硫氨基酸（ ALA-S-ALA）和β-甲基羊毛硫氨基酸（ALA-ABA），它们通过硫醚键形成五个内环。

乳链菌肽的抑菌谱包括营养体和芽孢，对葡萄球菌、梭菌、芽孢杆菌和利斯特菌有强烈的抑制作用，对酵母和霉菌没有作用。

迄今为止，乳链菌肽已在全世界约60多个国家和地区被用作食品防腐剂]。

我国对乳链菌肽的研究始于1989年，中国科学院微生物研究所在国家自然科学基金项目和中国科学院“八五”重点科研基金项目资助下，完成了对乳链菌肽的基础研究，研究成果现已批量生产，投放市场。

1992年3月29日，我国卫生部食品监督部门签发了乳链菌肽在国内的使用合格证明，同时将乳链菌肽列入1992年10月1日实施的国标GB2760-86中的增补品种，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品的保藏中。

乳链菌肽用于食品中的优点是安全无毒，它的LD50约为7000Kg，允许使用的最大剂量是33000IU/Kg，乳链菌肽是一种短肽，可以被体内的α-胰凝乳蛋白酶降解；不影响食品的色香味；在食品加工中可以降低杀菌温度、减少热处理时间，改变食品的营养价值、风味和结构等性状。

国内外的研究者在对乳链菌肽的分子结构、分子形成过程、物理化学性质、抗菌机理和毒性等进行了广泛的研究产nisin菌株在发酵食品中的应用在干酪中的应用早在1951Hirsch等研究发现nisin产生菌乳酸乳球菌乳酸亚种在Swiss型干酪中抑制厌氧产气芽孢的形成。

nisin最早应用于干酪的防腐，也是目前乳制品应用中的一个主要方面。

在干酪加工的过程中，虽经过高温灭菌，但仍会有耐热性的革兰氏阳性菌孢子（如肉毒梭状菌和厌氧的梭菌芽孢）存在，乳酸链球菌肽可有效地阻止这些孢子的萌发和毒素的形成，有报道说，将nisin抗性株和nisin产生菌混合用于干酪发酵剂，可使优质产品率达90%以上，而用常规的方法仅有41%。

学者们在这方面进行了大量的研究，nisin产生菌在干酪中应用的主要限制是生长缓慢和产酸率低。

Exterkate等（1976）产酸率低主要原因是缺乏蛋白酶系统。

是这些nisin产生菌只能利用乳中的可溶性含氮化合物。

Roberts等（1992）用电穿空法将质粒pFG010引入乳酸乳球C2中使其产生nisin抗性和红霉素抗性，然后将其与nisin 产生菌混合发酵，以期改变干酪的产酸度，但并未取得成功，由于这个质粒译码的抗性新陈代谢导致nisin失活。

Roberts等（1992）通过筛选发酵蔗糖nisin产生菌菌株获得一株自发突变的蛋白酶阳性菌株NCDO1404，用1%的NCDO1404和0.5%JS102混合用于cheddar干酪发酵，使产酸率提高，达到干酪的酸度要求，干酪中大约700IU/g的nisin。

此后，Roberts 等（1993）又将用nisin产生菌制作的干酪用于巴氏杀菌的干酪酱的一种配料成份，结果低湿度在22和37℃,高湿度在22℃贮存时，延长了货架期。

Berg等（1998）对Manchego干酪在成熟期间产nisin的乳酸乳球菌乳酸亚种ESI515对Listeria Innocua的抑制性进行了研究，发现成熟60天后，产nisin的发酵剂发酵干酪中L.innocua比不产nisin发酵剂酵的干酪细菌总数少约104个。

Rodríguez等(2001)]等通过杂交的方法获得一株nisin产生菌菌株TAB50，并将其用于抑制半硬质干酪中单核增生性李斯特菌。

Maisnier-patin等（1992）也将其用于Camember干酪中。

Rodríguez等（1998）[13]将其用于Manchego干酪均证明对李斯特菌有良好抑制作用。

使用产乳酸链球菌的作为发酵剂用于干酪的生产能达到抑菌的目的，其风味并未受到影响。

Abdelghani等（2001）将nisin产生菌与其他乳酸菌用于Hispßânico干酪的发酵发现加入nisin产生菌与不加产nisin发酵剂的干酪的pH值没有差别，菌落总数低。

每1Kg接种1.0gnisin产生菌发酵的干酪在成熟45天后，其蛋白水解度和游离氨基酸的数量分别是不加产nisin发酵剂的干酪的1.8倍和2.7倍，疏水的肽降低，3-甲基-1-丁醛、丁二酮和乙酰甲基甲醇浓度增加，干酪风味更好。

在泡菜中的应用Harris等（1992）将nisin产生菌乳酸乳球菌NCK401和nisin抗性的Leuconostoc mesenteroides NCK293混合用于泡菜的发酵中。

泡菜在最初发酵阶段是异型发酵的L占主导地位，由于L对酸敏感，随着酸度的上升，L迅速死亡，在发酵的后期是植物乳杆菌占主导。

这种微生物生长顺序使泡菜具有特殊的风味和香味，然而，在大批量的生产中，泡菜的这种自然发酵主要信赖于原料的微生物种群。

微生物的生长顺序受到生产条件的影响。

因此，很难扩大生产并维持泡菜质量的稳定。

乳酸乳球菌NCK401产生的nisin可以在初期抑制L 以外的其它微生物的生长，而不影响LNCK293的生长繁殖。

在混合发酵剂中100AU /ml的nisin轻微抑制植物乳杆菌ATCC14917。

600AU/ml可以完全抑制株菌的发酵。

由于后期的同型发酵是泡菜发酵中必不可少的，因此从实践的观点来看nisin并不是消除植物乳杆菌的生长。

通过实验将乳酸乳球菌和L比例定为103:1。

这种泡菜在含有2%的NaCl在20℃发酵获得了较高质量。

在酸奶中应用与干酪相比，nisin产生菌用于酸奶的发酵的研究应用较少，只有Kalra等（1975）研究了nisin产生菌与其它菌株混合发酵来阻止酸奶中酸的增加，以后他又研究了乳酸菌对nisin 的敏感性，及nisin产生菌对其他普通发酵剂的影响。

nisin产生菌在干酪中的应用已取得了可喜的成功，在泡菜和酸奶的应用中也有了初步的研究。

到目前为止，还未见产nisin的乳酸乳球菌用于其他发酵食品中，如果将nisin产生菌与其他nisin抗性菌株用于发酵食品中，可以抑制其它不需要的微生物的生长，减少或不必添加防腐剂，改善品质，延长保质期。

国内将产nisin的菌株用于发酵食品中还未见报道。

随着对nisin产生菌的特性的进一步的研究，产nisin的菌株在发酵食品中的应用必将大放异彩。

2、乳酸菌胞外多糖的研究进展多糖是近年来兴起的一个研究热点，掀起了继蛋白质和核酸之后的又一生物大分子的研究热潮。

人们之所以如此重视它，是因为它在生物体内所起的复杂且重要的生理作用。

近年来，由于许多发达国家诸如美国、日本和欧洲等对多糖研究的重视，使得这方面的研究取得了不少进展，使得人们对它有了更深的了解（顾瑞霞，2000）。

多糖是高度水合的聚合物，由重复单元（由单糖组成）以糖苷键链接而成，分为同聚多糖和杂多糖，其分子上还可以带有无机分子和有机分子的取代基。

多糖是一些变化多端的生物大分子，因为不但组成它们的单糖单位可以变化，而且这些单糖单位的链接方式也不定。

单糖上存在一些羟基，可以形成糖苷键，这就意味着任何两个单糖就可以以多种位置相连。

与之相比，任何两个氨基酸只能以两种方式链接成二肽。

此外，多糖中还存在许多支链，以及无几分子和有机分子的取代基，致使其结构尤为复杂（Roberts，1995）。

由此可见，复杂的多糖必定与复杂的生命现象关系密切。

生物界中，动物、植物和微生物都是多糖的丰富来源。

微生物的胞外多糖尤为重要。

微生物多糖包括某些细菌、真菌和蓝藻类产生的多糖，主要以三种形式存在：粘附在细胞表面上；分泌到培养基中;构成细胞的成分。

微生物多糖，因其安全无毒、理化性质独特等优良性质而倍受关注。

微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。

胞外多糖是由微生物大量产生的多糖，易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产。

据Ｄ.Ｅ.Ｅveleigh统计，已经发现49属76种微生物产生胞外多糖,但真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。

近几年,随着对微生物多糖研究的深入,世界上微生物多糖的产量和年增长量均在 1 0 %以上。

而一些新型多糖年增长量在3 0 %以上。

到目前为止,已大量投产的微生物胞外多糖主要有黄原胶(Xanthangum)、结冷胶(Gellangum)、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、热凝多糖(Curdlan)等。

微生物多糖具有植物多糖不具备的优良性质，它们生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。

目前,许多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等。

广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。

据估计，全世界微生物多糖年加工业产值可达50～1 0 0亿美元（魏培莲，2002）。

近年来，人们越来越关注乳酸菌产生的胞外多糖，因为乳酸菌是公认的有益菌，所以它们产生的胞外多糖也具有GRAS（普遍认为是安全的）地位（De Vuysthe 和Degeest 1999）。

用能产生胞外多糖的乳酸菌发酵乳，即使只产生少量的胞外多糖（60－400mg/L），也可使发酵物具有粘稠的质地（Cerning 1990）。

此外，胞外多糖还可以改善发酵乳的质地，使其质地象奶油一样光滑细腻（Macura 和Townsley 1984），并且还能减少酸奶的乳清析出和胶体断裂，从而成为酸奶稳定剂的替代品。

一些报道还称乳酸菌胞外多糖具有优良的生物学特性，如免疫活性（Oda et al. 1984）。

综上所述，乳酸菌胞外多糖具有很广阔的发展前景。