湖南农业大学毕业论文应用微卫星标记分析湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系****：**年级专业：2009级动物医学指导教师及职称：学院：继续教育学院湖南·长沙提交日期：湖南农业大学成人高等教育本科生毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
毕业论文作者签名：年月日目录摘要 (1)关键词 (1)一、前言 (1)二、材料与方法 (2)（一）材料 (2)（二）方法....................................................................................2-3 三、结果 (4)（一）牛样本DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (4)（二）湘西黄牛各杂交牛的遗传多样性分析 (4)（三）遗传距离分析 (4)四、分析与讨论 (5)（一）湘西黄牛各杂交牛的特有等位基因和缺失的等位基因 (5)（二）杂合度、期望杂合度、观测杂合度和多态信息含量 (6)参考文献 (6)致谢词 (6)应用微卫星标记分析湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系学生：陈东指导老师：（湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）摘要：为了分析湘西黄牛与国内外其他品种的亲缘关系，本研究利用8个微卫星标记对湘西黄牛进行了遗传多样性分析。
结果发现湘西黄牛等位基因丰富，在57-72个之间；平均多态信息含量在0.8547～0.9024之间，为高度多态性；平均杂合度在0.8867～0.9248之间；各杂交牛之间都存在一些特有等位基因和缺失等位基因；通过Nei’s聚类分析，其与引进种公牛的遗传距离较大，与国内4个优良肉牛品种相比，可以单独聚为一类。
关键词：湘西黄牛；微卫星；亲缘关系；遗传距离一、前言进入20世纪70年代以来，随着DNA重组技术的产生以及分子生物学、分子遗传学等学科的迅猛发展，人类已经能够从分子水平上对遗传物质 DNA的结构进行更直接、更精确的研究，并建立了一系列的分子遗传标记 ( Molecular Genetic Markers )技术。
由于微卫星 DNA标记具有多态性高，呈共显性遗传，能准确判别等位基因，遍布于整个基因组且分布均匀等特点，在畜禽遗传育种工作中被广泛应用于构建基因图谱[1-4]，制作DNA指纹图谱[5-7]，定位功能基因和数量性状座位(QTL)[8]，进行血缘鉴定和血缘控制[9-10]，遗传多样性评估等研究。
汤青萍等[11]利用微卫星标记对中国部分地方鸡种的遗传多样性进行了分析、Reed等利用微卫星座位对家鸡和火鸡的遗传结构进行了对比分析[12]、牛荣等利用35个微卫星座位对版纳小耳猪近交系进行了遗传分析[13]、张亚平等对大熊猫微卫星DNA的筛选及应用进行了研究[14]。
湘西黄牛是湖南省地方家畜优良品种，为了能更有效地对地方品种开展合理保护、开发和利用，本研究采用微卫星 DNA标记对湘西黄牛与国内外的8个其他黄牛品种的遗传多样性进行研究，以期为相关工作提供必要的遗传学依据。
二、材料与方法（一）材料1.实验材料采集湘西黄牛的杂一代牛作为实验样本，采样地点分别在永顺县（152头）和新晃县（245头）两个地方，其中利本杂104头，西本杂88头，安本杂127头，夏本杂78头。
湘西黄牛DNA样品来自于湖南省畜牧研究所库存，利木赞、西门塔尔、安格斯以及夏洛来牛样品来自于湖南省畜牧研究所种公牛站提供的冻精。
鲁西牛、秦川牛、晋南牛、南阳牛和延边牛DNA样品及数据来自西北农林科技大学。
2.试剂全血基因组提取试剂盒购自上海生工；DNA回收试剂盒、PCR试剂购自天为时代；引物合成为上海英骏生物技术有限公司。
3.仪器梯度PCR仪（Eppendorf）、琼脂糖凝胶电泳系统（六一仪器厂）、聚丙烯酰胺凝胶电泳系统（六一仪器厂）、凝胶成像系统(TANON)、低温高速离心机（Eppendorf）、常规试剂均为分析纯等级。
（二）方法1.微卫星座位的选择通过Genebank[http:/genome/cattle/cattle.html]选择与黄牛日增重及部分经济性状相关的、多态性丰富的微卫星标记对样品DNA进行扩增，合成的微卫星引物序列见表1。
表1 微卫星引物座位、引物序列、退火温度及登录号Table1 Microsatellite loci,primer sequences,anneal temperature and genebank accession 座位正向引物反向引物退火温度登录号IDVGA44 IDVGA27 IDVGA-2 IDVGA-46 IDVGA-11 ETH3 ETH225 BM1824 TGGTCAGTCACAGAGAAGCACAGTGGTCAGTCACAGAGAAGCACAGGTAGACAAGGAAGCCGCTGAGGAAATCCTTTCAAGTATGTTTTCACCTTCTGGCAACCACCTATTTGGAACCTGCCTCTCCTGCATTGGGATCACCTTGCCACTATTTCCTGAGCAAGGTGTTTTTCCAATCGAAAGCCTGGACTCATGGAATAGAAAGCCTGGTACTCATGGAATAGAGAAAAGCCAAGAGCCAGACCACTCACTCCAGTATTCTTGTCTGCCACCTAAGTGTCTCCTGATGGAACTCTGCCTGTGGCCAAGTAGGACATGACAGCCAGCTGCTACTCATTCTCCAACTGCTTCCTTG6360565758616056X85095X85046Z27071X85062Z27077Z22744Z14043G183942.样本DNA的提取选择湘西黄牛与国外引进纯种公牛杂交所产生的F1代牛作样品，从牛颈静脉或耳静脉采血，采集血液样品用ACD抗凝（ACD:血液＝6:1），用全血基因组提取试剂盒提取样本总DNA，DNA于－20℃下保存备用。
3.PCR 反应和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR 反应体系为20μL：其中含10×Buffer 2μL；10 μmol/L 引物1μL；2mmol/mLdNTP 1μL；50ng/μL DNA 模板1 μL；2U TaqDNA 聚合酶，补水至20 μL。
PCR 反应程序:95℃预变性5 min ；95℃变性30 s ，退火45 s （各微卫星引物退火温度不同，退火温度见表1）,72℃延伸30 s ，35 个循环，72℃延伸8 min 。
PCR 扩增产物在2.5％琼脂糖凝胶电泳，电压为5V/cm ，电泳后在凝胶成像系统中检验扩增结果，凡没有杂带的产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4.数据统计与分析（1）等位基因频率N ii = （N ii 为具有纯合子a i a i 基因型的个体数，n ij 为具有杂合子a i a j 基因型的个体数，N 为个体总数。
）（2）基因杂合度 ∑=-=n i iq h 121 ∑==r j j r h H 1/（其中，r 为检测的位点数，n 为等位基因数，q i 为第r 个位点第i 个等位基因的频率）（3）多态信息含量（PIC ） )2()(11221112∑∑∑+=-==--=n i j j i n i n i i q q q PIC（其中q i 、q j 为等位基因频率，n 为等位基因数）（4）有效等位基因数（p i 为等位基因的频率） （5）遗传距离Ne i’s 标准遗传距离法 Ds ＝－ln （Jxy/JxJy ）（6）聚类分析根据Saitou 和Nei 提出的Neighbor-joining 方法进行聚类分析。
三、结果（一）牛样本DNA 的聚丙烯酰胺凝胶电泳通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并用硝酸银染色，对8对微卫星引物扩增湘西黄牛杂一代基因组DNA 的部份结果如图1。
图1 部分个体在微卫星IDVGA27座位上的扩增结果)()2/()2(1,11j i N n n q n i j i ij n i ii i ≠+=∑∑+=== ∑==in i i p Ne 12/1Fig1 A portion of PCR results of IDVGA27Marker: PUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ）（二）湘西黄牛各杂交牛的遗传多样性分析通过8对微卫星引物西本杂、利本杂、安本杂、夏本杂进行了等位基因检测，其中西本杂检测到69个等位基因、利本杂检测到72个等位基因、安本杂检测到67个等位基因、夏本杂检测到57个等位基因。
（三）遗传距离分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法测定了从西北农林科技大学提供的南阳牛、秦川牛、延边牛及郏县牛DNA样品和湖南省畜牧研究所提供的西门塔尔牛、利木赞牛、安格斯牛、夏洛来牛样品，计算出它们的等位基因数和等位基因频率，根据基因频率计算出湘西黄牛与这几个肉牛品种间的Nei’s遗传距离。
依据品种间遗传距离进行聚类分析，结果见表2和图2。
表2 湘西黄牛与国内外优良肉牛品种间Nei’s遗传距离Table2 Nei’s genetin distance between Xiangxi-yellow cattle and other breed01 02 03 04 05 06 07 080102 0.283203 0.2138 0.106604 0.2944 0.0849 0.097305 0.3026 0.1238 0.1208 0.096806 0.4132 0.4463 0.3842 0.3346 0.324707 0.3839 0.3734 0.3891 0.3545 0.3639 0.184208 0.3240 0.3021 0.3040 0.2894 0.2471 0.2435 0.231409 0.4037 0.3577 0.3249 0.3747 0.2842 0.2034 0.1942 0.1067注：01 湘西黄牛； 02 南阳牛； 03 秦川牛； 04 延边牛； 05 郏县牛； 06 西门塔尔牛；07利木赞牛； 08 安格斯牛； 09 夏洛来牛通过表2可以看出，湘西黄牛跟南阳牛、秦川牛、延边牛及郏县牛之间遗传距离都比较大，因此需将湘西黄牛单独规为一类，南阳牛和郏县红牛之间以及秦川牛和延边牛之间遗传距离都较小，可以分别聚为两类；而这些国内黄牛与国外肉牛西门塔尔牛、利木赞牛、安格斯牛以及夏洛来牛的遗传距离都比较大，在国外品种中，西门塔尔跟夏洛来牛遗传距离较小，可以跟利木赞牛一起聚为一类，安格斯牛跟这些牛相比遗传距离相对较大，可单独聚为一类。