3　讨论

构建真核表达载体首先要根据其用途和基本策略进行严

密的实验设计,如果将目的片段和载体质粒分别双酶切后进

行连接,会因酶切效果不理想导致缺失。因此本研究采取T

载体克隆的方法将目的片段连入PMD-19T载体中,然后从

PMD-19T重组载体上酶切下目的片段再与同样经酶切处理

的PcDNA3载体进行连接,这样就保证了重组质粒PcDNA3-

hLYZ构建的成功和准确,为研究hLYZ基因的真核表达奠定了

基础[6]。

对上述阳性克隆进行DNA测序,结果表明扩增的5’和3’

调控区与已发表的序列的同源性较高。该调控序列在牛、人

和鼠的相应区域进行比较同源性均为97%～100%,说明该调

控序列在人、牛和小白鼠上具有较高的保守性[7]。

对于构建特异表达载体来说,5’和3’UTR的特异启动子

和调控系列尤为重要。许多研究证实其酪蛋白基因5’端和3’

端UTR及启动子是乳腺特异表达的关键调控原件。另外,乳

蛋白基因UTR是构建乳腺生物反应器表达载体的核心生物元

件[8]。目前已经用于转基因动物乳腺生物反应器的调控元件

主要有:β-乳球蛋白基因、aS1和β-酪蛋白调控序列、乳清酸

蛋白基因调控序列和乳清白蛋白基因调控序列[9]。近二十年

的研究证明,以β-乳球蛋白和β-酪蛋白基因调控序列构建

的乳腺生物反应器表达载体在绵羊、山羊和奶牛上获得高水

平表达,而乳清酸蛋白基因调控序列指导的蛋白则在兔和猪

等动物上有较高水平的表达,但各有优缺点[3]。国外研究报

道表明酪蛋白是在乳腺的特异表达的蛋白质,是乳腺的主要蛋白[10]。pC-hLYZ载体的成功建立为研究酪蛋白基因5’端

和3’端的调控序列的调控机理和调控特性提供了一个平台;

并用上述牛乳腺特异表达载体表达药用蛋白,建立具有产业

开发价值的牛乳腺高效表达技术体系和进一步制作转基因动

物奠定了基础。

参考文献:

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高效表达可溶性重组蛋白表达载体———pHisSUMO

李璐1,尹成凯2,李德山23

(1.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,黑龙江哈尔滨150030;2.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)

摘要:目的:构建含有IL-1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验证pHisSUMO表达载体的高效可溶性表

达。方法:以质粒pMD18-T-IL-1为模板,利用PCR获得IL-1基因克隆并将其与表达载体pET、pTYB、pHisSUMO连接,重组质

粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5α中,并检测其蛋白表达情况。结果:仅在pHisSUMO表达系统获得了IL-1融合蛋白的高效可

溶性表达。利用Ni-NTA纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟蛋白且不残留任何氨基酸残基。结

论:实验证明pHisSUMO表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量。

关键词:pHisSUMO;高效表达载体;SUMO蛋白酶

中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2009)03-0011-04

AnExpressionVectorforEfficientExpressionofSolubleRecombinant

Proteins———pHisSUMO

LILu1,YINCheng-kai2,LIDe-shan23

(1.LifeScienceandBiotechniqueResearchCenter,NortheastAgricuturalUniversity,Harbin150030,China;2.CollegeofLifeScience,NortheastAgricuturalUniversity,Harbin150030,China)

Abstract:Objective:ToconstructtheprokaryoticexpressionplasmidincludedIL-1geneanddetecttheresultofexpression,toverifypHisSUMO

forefficientexpressionofsolublerecombinantproteins.Method:PlasmidpMD18-T-IL-1wastakenasthetemplatefirstly,IL-1genewas

clonedbyPCRandconnectedtotheexpressionvectorpET,pTYBandpHisSUMO,thentherecombinantplasmidwasidentifiedandtransformed

intoE.coliDH5αcompetencecell,andtheexpressedproteinwouldbedetected.Result:Highyieldofthefusionproteinwasonlyacquiredin

pHisSUMOexpressionsysteminsolubleform.ThehumanIL-1withhighpuritywasharvestedwithoutanyadditionalaminoacidresidue,afterNi

-affinitychromatographypurificationandcleavagebySUMOproteaseⅠ.Conclusion:ThedatashowthatpHisSUMOexpressionsystemishelp2

fultoenhancethesolubilityandyieldofinterestedproteins.

Keywords:pHisSUMO;highefficientexpressivevector;SUMOprotease

收稿日期:2008-11-07;修回日期:2009-03-20基金项目:黑龙江省科技攻关重点项目资助(GB06C315)作者简介:李璐(1975-),女,硕士,实验师,研究方向:生物制药学;3通讯作者:李德山(1950-),男,博士生导师,教授,从事生物制药学研究,Email:deshanli@163.com。 目前,重组蛋白的表达主要是利用大肠杆菌,其具有使用

安全、操作简便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等优点,

是重组蛋白药物研究和生产中使用最广泛的表达系统[1,2]。

重组蛋白表达关键的问题是选用合适的表达载体,现已建立的大肠杆菌表达系统有融合表达、非融合表达、分泌表达、带

纯化标签的表达载体等,而融合表达载体又有pET系列、

pTYB、pGEM及pGEX等。表达载体的类型虽多,但选择合适

的、满足人们需求的表达载体却很难,如pET系列载体虽然应

用较广泛,但对有些蛋白的表达却不是很理想。而其它一些

融合蛋白表达系统蛋白表达量虽然很高,但多数表达的目的

蛋白可溶性较差。这就要求我们去寻找更多的高效稳定、可

溶性较好的表达系统以满足不同类型基因的表达。

我们在表达IL-1的过程中,发现在大肠杆菌中难以获得

高效稳定的可溶性表达,其原因可能在于该蛋白在大肠杆菌112009年19(3) 生　物　技　术 中较易被蛋白酶降解。我们试验过很多表达载体表达效果均

不理想,如pET系列表达载体、pTYB-11等表达系统对以上蛋

白的表达量极低或者几乎不表达,pGEX6p-1虽然表达量较

高,但可溶性目的蛋白所占比例较小。

SUMO(smallubiquitin-likemodifier-1)是一种小分子泛素

样修饰蛋白[3,4],广泛存在于各种真核细胞中,参与调节细胞

凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等

多种生理进程[5]。近年来,SUMO被发现可以作为重组蛋白表

达的融合标签和分子伴侣,具有抗蛋白酶水解、显著增加重组

蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠,提高可溶性等功

能[6-8]。小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)和泛素(Ub)在一级结

构上只有18%的同源性,然而,两者的三级结构及其生物学功

能却十分相似[9],研究表明其作为重组蛋白的融合标签可以

增加蛋白的稳定性。现本文以IL-1为例,试验pHisSUMO蛋

白融合表达系统的应用。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　实验材料:质粒和受体菌:质粒pMD18-T-His-IL-1

(pMD18-T为TaKaRa公司的T载体);pHisSUMO(购于lifeSen2

sors公司)、pET-30a(+)、PTYB-11载体由本实验室提供;受

体菌E.coliDH5α、Rosetta(含DE3)由本实验室提供。

克隆pET30a(+)-IL-1引物:

P1上游:5’GGGGAATTCATGGCACCTGTACGA3’EcoRⅠ;

P2下游:5’CCCGTCGACTTAGGAAGACACAAA3’SalⅠ。

克隆pTYB11-IL-1引物:

P3上游:5’AACAGAAGAGCACCTGTACGATCACTGAAC3’

SapⅠ;

P4下游:5’ACGCGTCGACTTCCACATTCAGCACA3’SalⅠ。

克隆pHisSUMO-IL-1引物:

P5上游:5’GGTCTCAAGGTGCACCTGTACGATCACT3’BsaⅠ;

P6下游:5’CGGGATCCGTACAGCTCTCTTTA3’BamHⅠ。

1.1.2　试剂

BsaⅠ、BamHⅠ、SapⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ购自NewEngland

BioLabs公司;pMD18-T、dNTPs、其它限制性内切酶、T4DNA连

接酶购自TaKaRa公司,SUMO蛋白酶Ⅰ购自LifeSensors公司。

IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷),溶菌酶,卡那霉素购自

TaKaRa公司。DNA回收试剂盒,购自上海华舜生物工程有限

公司。Ni-NTA琼脂糖颗粒购自QIAGEN公司。

1.1.3　仪器

Milli-QⅡ型纯水仪(美国密理博公司)、-70℃超低温冰

箱(日本三洋公司)、AvantiTM30型高速冷冻离心机(美国贝克

曼公司)、DU640紫外分光光度计(美国贝克曼公司)、PTC-200

梯度PCR仪(美国伯乐公司)、ChampgelTM5000凝胶成像系统

(美国阿尔法公司)、MA120型垂直板电泳系统(美国伯乐公

司)、LaboAutoclave高压灭菌锅(日本三洋公司)、721分光光度

计(中国上海第三分析仪器厂)、-20℃冷冻冰柜和4℃冷藏冰

箱(中国海尔)。

1.2　方法

1.2.1　融合蛋白表达载体的构建

1.2.1.1　pET-30a(+)表达质粒的构建

以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P1、P2为引物,用

rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SalⅠ和EcoRⅠ双酶

切,回收酶切片段;将pET-30a(+)表达载体用SalⅠ和EcoR

Ⅰ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的IL-1PCR产

物与pET-30a(+)表达载体的回收产物利用T4连接酶进行

连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质

粒,SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆。

1.2.1.2　pTYB-11表达质粒的构建

以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P3、P4为引物,用rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SapⅠ和SalⅠ双酶

切,回收酶切片段;将pTYB-11表达载体用SapI和SalⅠ双酶

切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的IL-1PCR产物与

pTYB-11表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将

连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,SapⅠ和

SalⅠ双酶切鉴定阳性克隆。

1.2.1.3　pHisSUMO表达质粒的构建

以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P5、P6为引物,用

rTaq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用BsaⅠ和BamHⅠ双

酶切,回收酶切片段;将pHisSUMO表达载体用BsaⅠ和BamH

Ⅰ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的IL-1PCR产

物与pHisSUMO表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连

接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,

XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆。

阳性克隆测序,具体测序方法见CEQ8000操作流程。

1.2.2　目的基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的纯化

将含有正确序列的重组质粒pET-30a(+)-IL-1、pTYB

-11-IL-1、pHisSUMO-IL-1转化至表达菌株Rosetta。转化

后的单菌落分别接种至5mLLB培养基中,37℃培养10h,以1:

100接种于500mL含卡那霉素(50mgΠmL)的LB培养基中,37℃

培养2h,A600=0.3～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.5mmolΠL

进行诱导,诱导3h后分别取少量菌体及未诱导的对照样品进

行12%SDS-PAGE[11]电泳。收获pHisSUMO-IL-1转化至表

达的菌体进行超声破碎后离心[11],分别取上清和沉淀进行

12%SDS-PAGE电泳分析。加入IPTG至终浓度为0.5mmolΠL

进行诱导1h、2h、3h、4h、5h,摸索最佳诱导时间,分别加入IPTG

至终浓度为0.1mmolΠL、0.2mmolΠL、013mmolΠL、0.4mmolΠL、0.5

mmolΠL诱导3h进行浓度梯度诱导,摸索最佳诱导浓度。

菌体经超声破碎后离心,上清经Ni-NTA柱亲和层析,用

杂蛋白洗脱液(30mmolΠL咪唑,300mmolΠLNaCl,50mmolΠL

NaH2PO4,pH8.0)洗去杂蛋白后,用洗脱液(250mmolΠL咪唑,

300mmolΠLNaCl,50mmolΠLNaH2PO4,pH8.0)洗脱融合蛋白,收

集洗脱的第一、二峰。取融合蛋白5μl进行SDS-PAGE电泳

分析。

1.2.3　融合蛋白的切割

将方法1.2.2收集的pHisSUMO-IL-1融合蛋白(浓度为

1mgΠml)经PBS透析24h后,以每10μg融合蛋白:1USUMO蛋

白酶Ⅰ的比例加入SUMO蛋白酶Ⅰ,DTT终浓度为2mmolΠL,

4℃切割过夜,并取样进行15%SDS-PAGE检测。

1.2.4　成熟蛋白的纯化

切割后产物经PBS缓冲液透析以除去切割液,再经Ni-

NTA颗粒亲和层析,收集惟一的洗脱峰,即为IL-1成熟目的

蛋白,用洗脱液(250mmolΠL咪唑,300mmolΠLNaCl,50mmolΠL

NaH2PO4,pH8.0)洗脱Ni-NTA颗粒结合的小泛素相关修饰

物蛋白,15%SDS-PAGE电泳检测。

2　结果与分析

2.1　pMD18-T-IL-1插入片段克隆

以质粒pMD18-T-IL-1为模板,以P1、P2为引物进行

PCR扩增后,产物大小为450bp左右与预期产物大小相符(如

图1)。

测序结果(略)与Genebank发表序列一致459bp。

2.2　融合蛋白表达载体的构建

将胶回收的IL-1基因序列与线性化的pET-30a(+)表

达载体、pTYB-11表达载体、pHisSUMO表达载体连接。重组

表达载体pHisSUMO-IL-1经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定

后,获得产物为450bp左右的条带,重组表达载体pTYB-11-

IL-1经SapⅠ和SalⅠ双酶切鉴定得到450bp左右的条带,重

组表达载体pET30a(+)-IL-1经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴21 生　物　技　术 2009年19(3)