第1讲 基因工程[考纲展示] 1.基因工程的诞生(Ⅰ) 2.基因工程的原理及技术(含PCR 技术)(Ⅱ) 3.基因工程的应用(Ⅱ) 4.蛋白质工程(Ⅰ)考点一| 基因工程的基本工具1．基因工程的概念(1)概念：是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。

(2)遗传原理：基因重组。

(3)优点①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。

②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。

2．基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。

①来源：主要来自原核生物。

②特点：具有专一性，表现在两个方面：识别——双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列。

切割——特定核苷酸序列中的特定位点。

③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

④结果：产生黏性末端或平末端。

(2)DNA 连接酶①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

②质粒的特点⎩⎪⎨⎪⎧能自我复制有一个至多个限制酶的切割位点有特殊的标记基因③作用：携带外源DNA 片段进入受体细胞。

[思考回答]1．原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA?提示：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。

2．图甲表示Eco R Ⅰ限制酶及DNA连接酶的作用示意图，图乙表示SmaⅠ限制酶的作用示意图。

请据图回答问题：(1)请写出Eco R Ⅰ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列以及切割位点。

提示：Eco R Ⅰ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。

(2)限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？DNA连接酶起作用时，是否需要模板？提示：相同，都是磷酸二酯键。

不需要模板。

1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。

(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。

(3)限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。

(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。

2．限制酶和DNA连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。

(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。

3．载体(1)条件与目的①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。

②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

◎考法1 考查限制酶、DNA连接酶等酶的作用[解题指导] 确定选择限制酶种类的方法1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

2．根据质粒的特点确定限制酶的种类(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了Eco R Ⅰ、Bam H Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的Eco R Ⅰ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

图(a)图(b)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经Bam H Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_________________________________________________________________________________________________________________________________。

(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。

这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________。

图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有___________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。

解析：(1)由题图可知，Bam H Ⅰ和Sau3A Ⅰ两种限制性内切酶的共同识别序列是错误!，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经Bam H Ⅰ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。

(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。

图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。

(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。

答案：(1)Sau3A Ⅰ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。

请回答下列问题：图1 图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。

为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。

(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR 鉴定，所用的引物组成为图2中________。

(3)若Bam H Ⅰ酶切的DNA 末端与Bcl Ⅰ酶切的DNA 末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。

(4)若用Sau 3A Ⅰ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA 片段。

解析：(1)选择的限制酶应在目的基因两端且在质粒中存在识别位点，故可以用来切割的限制酶为Bcl Ⅰ、Hind Ⅲ、Bam H Ⅰ和Sau 3A Ⅰ，但由于Bam H Ⅰ和Sau 3A Ⅰ可能使质粒中的启动子丢失或破坏抗性基因，所以应选用Bcl Ⅰ、Hind Ⅲ两种限制酶切割。

酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA 连接酶作用后获得重组质粒。

为了扩增重组质粒，需将其转入感受态的大肠杆菌中，使其增殖。

(2)根据质粒上抗性基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。

平板上长出的菌落，常用PCR 鉴定，目的基因DNA 受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。

(3)若Bam H Ⅰ酶切的DNA 末端和Bcl Ⅰ酶切的DNA 末端连接，连接部位的6个碱基对序列为T GATC C A CTAG G ⎝ ⎛⎭⎪⎫G GATC A C CTAG T ，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。

(4)根据Bcl Ⅰ、Bam H Ⅰ和Sau 3A Ⅰ的酶切位点，Sau 3A Ⅰ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A 、B 、C 三种片段，若部分位点被切开，可得到AB 、AC 、BC 、ABC 四种片段，所以用Sau 3A Ⅰ切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA 片段。

答案：(1)Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ DNA 连接 感受(2)四环素 引物甲和引物丙(3)T GATCC A CTAGG ⎝ ⎛⎭⎪⎫G GATC A C CTAG T 都不能 (4)7 ◎考法2 考查载体的作用及特点等3．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA 插入到Amp r 或Tet r中会导致相应的基因失活(Amp r 表示氨苄青霉素抗性基因，Tet r 表示四环素抗性基因)。

有人将此质粒载体用Bam H Ⅰ酶切后，与用Bam H Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。

结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。

被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________；并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是_________________________________________。

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。

(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA 复制所需的原料来自于________。

解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA 片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA 上，随染色体DNA 进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择等等。