甘露聚糖酶活力的测定
一、原理
甘露聚糖酶能从底物LBG(Gum, Locus Bean 洋槐豆粉)中水解产生还原糖。

还原糖的产生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。

二、酶活力单位（U）的定义
在40℃、pH 6.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mL LBG底物溶液生成1μg还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），其中样品的酶活力以U/g（固体酶）或U/mL（液体酶）表示。

三、主要仪器
3.1 紫外可见分光光度计
3.2 电子天平：感量0.0001g
3.3 恒温水浴锅30~60℃可调，精度为0.1℃。

3.4 pH 计：精确至0.01
3.5 秒表：每小时误差不超过5s。

3.6 离心机：3000-4000g
3.7 移液器：1-5mL可调，精度1μL。

四、试剂与溶液配制
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。

4.1 0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：
称十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g，柠檬酸8.07g，溶于900mL蒸馏水中，用0.2M NaOH溶液或0.2M HCL溶液调至pH6.0，加蒸馏水定容至1.0L，混匀。

4.2 氢氧化钠溶液（200g/L）：
称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。

4.3 DNS 试剂：
称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。

然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（4.2），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。

再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。

继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。

停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。

用烧结玻璃过滤器过滤。

取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。

室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。

4.4 LBG （洋槐豆粉）底物溶液，浓度10mg/mL：
准确称取1.00gLBG (洋槐豆粉，Sigma G0753)，徐徐加入90mL 0.05M pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）中，磁力搅拌缓慢加热，直至LBG完全溶解。

然后停止加热，继续搅拌30min。

冷却后，用0.05M pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至100mL，LBG底物溶液能立即使用，使用前适当摇匀。

此溶液标记为10mg/mL LBG底物溶液pH6.0，4℃避光保存，有效期为3天。

4.5 10mg/mL甘露糖标准液
称取无水甘露糖1.000g（应在105℃烘至恒重的，一般2h），用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）溶液，定容于100mL。

五、标准曲线的制作
分别吸取10mg/mL甘露糖标准液（4.5）0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL于100mL 容量瓶中，用pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）稀释至刻度，得到0，100，200，300，400，500，600μg/mL的标准稀释液。

取不同浓度稀释液各2mL于试管中，加2mL pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1），DNS试剂（4.3）5mL，于沸水浴沸腾5min（样品放入从新
沸腾计时），取出后立即用自来水冷却至室温，并加入蒸馏水定容至25mL ，混匀，以不含甘露糖的为空白，在540nm 处分别测定其吸光度OD 值，记录OD 值。

以吸光度OD 值为横坐标，以相应甘露糖浓度为纵坐标，绘制出标准曲线或作回归方程（R 2值要大于0.998才能使用，否则应重做）。

每次新配制DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。

六、测定步骤
6.1 待测酶液的制备
固体酶样：准确称取1g 样品（微丸酶应先粉碎），精确至0.0001g 置于100mL 容量瓶中，加入约70mL 0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1），在磁力搅拌器上高速搅拌20min(这很重要，抽提时间不足对酶活影响很大)，用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至刻度（减去磁力搅拌棒的体积），摇匀，在离心机上以4000r/min 离心10min ，取1.0mL 上清液用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）作适当稀释（吸光度OD 值在0.2-0.4之间），等待反应。

液体酶样：吸取5mL 液体酶在离心机上以4000r/min 离心10min ，取1.0mL 上清液用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至100mL 作为待测酶液（用前作适当稀释；吸光度OD 值在0.2-0.4之间），等待反应。

6.2 测定
6.2.1 吸取10.0mL 10mg/mL LBG 底物溶液（4.4），40℃平衡10min 。

吸取10.0mL 经过适当稀释的待测酶液，40℃平衡10min 。

6.2.2 酶空白样的制备
吸取2.00mL 经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mL DNS 试剂（4.3），振荡3s 。

然后加入2.0mL LBG 底物溶液（4.4），40℃保温20min ，沸水浴加热5min 。

用自来水冷却至室温，加水定容至25mL ，振荡3s 。

以此作为下步反应空白调零样。

6.2.3 酶反应样
吸取2.00mL 经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0mL LBG 底物溶液（4.4）（已经过40℃平衡），振荡3s ，40℃精确保温20min 。

加入5.0mL DNS 试剂（4.3），振荡3s ，以终止酶解反应。

沸水浴加热5min ，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL ，混匀。

以酶空白样（6.2.2）为空白调零，在540nm 出测定吸光度OD 值。

需做2个平行。

查标准曲线或回归方程式，求出样品中还原糖量。

OD 值以在0.2-0.40范围为宜，若不在此范围需改变稀释倍数后再做。

七、结果表示与计算按式（1）
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N A X ⨯= …………（1） 式中：
X ——试样甘露聚糖酶的活力，U/g 或U/mL ；
A ——从标准曲线中查得的还原糖量，μg ；
N ——稀释倍数（从固体样品到最终液的总稀释倍数）；
20——20分钟的反应时间。

八、重复性
同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值。