第四章透射电子显微分析技术（二）推荐一本参考书《生物医学电镜样品制备方法》-----戴大临张清敏著透射电镜生物医学试样的制备 一超薄切片技术◆超薄切片的常规程序◆超薄切片使用的设备◆超薄切片使用的试剂及配方二生物样品的负染色技术一、超薄切片技术透射电镜生物医学试样超薄切片的制作过程需要经过取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋（聚合）、切片及染色等步骤。

超薄切片常规程序◆取样：大小1mm3；◆醛类(如戊二醛）预固定：2-4小时；◆缓冲液清洗几次，中间更换新的缓冲液；◆锇酸后固定：0-4℃下1-4小时；◆缓冲液清洁半小时以上；◆乙醇或丙酮的上升系列脱水，其顺序为：50%，70%，80%，90%，95%各一次，每次5-15分钟，100%2-3次，每次5-15分钟；◆包埋剂浸透，包埋；◆聚合，60℃下聚合24-36小时，或者在紫外线下聚合24-48小时；◆超薄切片◆染色图解超薄切片试样制备过程（－）取材1.取材的基本要求：◆快取材的动作要迅速，最好在材料离体后１min内就进入固定液；解剖器械要锋利，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。

◆准取材要准确。

①器官要准确②部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。

◆冷取材过程应尽量在低温下进行（０～４℃），以降低酶的活性，减少细胞内结构的损失。

◆小所取材料体积要小，一般不超过１㎜3。

因为固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。

2.取材方法A．动物及人体组织的取材：应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死后，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1mm宽，2～3mm长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成１mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（０～４℃）。

B．体外培养细胞的取材：生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置３～５min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2000转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。

C．植物组织的取材：植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。

（二）固定1.固定的概念：用化学固定剂或冰冻、干燥及高温等物理方法迅速杀死细胞、以保持细胞形态结构不变的过程叫固定。

固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器及大分子保持生活状态的结构，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。

经过良好固定的细胞器和大分子，不会由于一系列后继的处理而发生移位或丢失。

固定方法有化学固定法及物理固定法两大类，其中常用的是化学固定法。

2.几种常用的固定剂：理想的固定剂应具有下列条件：A．能迅速而又均匀地渗入组织细胞内，并尽快杀死细胞以减少“死后变化”；B．能稳定细胞的各种结构成分，使之在脱水、渗透等过程中不溶解或损失；C．细胞结构形态不收缩或膨胀，无人工假象或变形；D．能保存酶的活性，以供电镜的细胞化学测定。

实践中较理想的固定剂有四氧化锇（锇酸）和戊二醛两种。

其它还有高锰酸钾、多聚甲醛等。

①四氧化锇通称锇酸。

是一种淡黄色具有强烈刺激味的有毒晶体。

其分子式为OsO4，水溶液是中性的。

四氧化锇是一种强氧化剂，具有极大的毒性，操作时必须十分小心。

固定时间约为2小时，如时间太长，使蛋白复合体溶解，使组织块发脆，造成切片困难。

②戊二醛1963年开始采用，是现今广泛应用于电镜上的良好固定剂，对细胞内结构有良好的固定作用。

常用它作为预固定剂，浓度通常为1.5－5％，时间一般为2小时。

③高锰酸钾一种强氧化剂，对磷脂蛋白类有特别良好的固定作用，可用于保护细胞膜、内质网膜、线粒体外膜等，尤其对神经髓脂质的固定效果更为显著，目前使用较少。

④甲醛其水溶液俗称福尔马林，甲醛的反应速率比戊二醛慢，对细胞精细结构的保存也不如戊二醛，但在酶活性的保存上却优于戊二醛，故甲醛一般多用于组织化学或快速固定。

固定方式①常规组织块的二次固定法这种方法适合于大多数组织的浸泡固定。

A：预固定用2.5％戊二醛磷酸缓液冲液或二甲胂酸钠缓冲液或用2％多聚甲醛加2.5％戊二醛在4℃下固定1－2小时，固定液用量不少于组织体积的40倍。

B：在4℃下用缓冲液洗涤，必须彻底洗去残余的戊二醛，时间为2小时或更长，中间换液数次。

如戊二醛固定时间延长，则漂洗时间亦相应延长。

洗涤液尽量采用同系列的缓冲液。

C：后固定在4℃下用1％锇酸固定液固定1.5－2小时。

②体外培养细胞的固定法③外周血细胞采集及固定方法④原位固定法与灌流固定法常用固定液的配制①锇酸固定液的配制市售的锇酸是一种淡黄色晶体，一般用安锫瓶封装，有0.1、0.5、1.0克三种。

因受热和光照会促使其氧化，故需要保存于避光和阴凉处。

配制锇酸的容器宜选用棕色磨口玻璃瓶，充分洗净。

配制前，先将锇酸安锫瓶洗净，双蒸水冲洗，滤纸吸干。

用金刚石在瓶壁中央小心划出痕纹，放入棕色瓶内，盖好瓶盖。

振破安锫瓶后，按比例加入双蒸水，加盖后外部套上塑料袋，封紧或用石蜡密封瓶口，置冰箱中让其缓缓溶解。

放三天以上方能完全溶解，成为无色或稍带淡黄的液体。

锇酸是极毒品，对呼吸道粘膜、眼角膜都有固定作用，操作者应尽可能避免与锇酸及其蒸气接触，应在通风橱内操作。

a：先配2％锇酸水溶液b：用磷酸缓冲液配制的1％锇酸固定液②戊二醛固定液的配制A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为25%的水溶液）戊二醛最终浓度（%）1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 0.2M磷酸缓冲液（ml）50 50 50 50 50 50 50 25%戊二醛水溶液（ml）4 6 8 10 12 16 20双蒸水加至（ml）100 100 100 100 100 100 100B、0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液戊二醛最终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00.2M二甲胂酸钠缓冲液（ml）50 50 50 50 505%戊二醛水溶液（ml） 4 6 8 10 12双蒸水加至（ml）100 100 100 100 100（三）清洗与脱水由于锇酸能与乙醇作用生成沉淀，因此，在脱水之前，宜用缓冲液将多余的锇酸清洗干净，时间可从30分到几小时，有的甚至清洗过夜，其间应更换几次缓冲液。

脱水的作用是用一种中间液体（脱水剂）来代替样品中所有的游离水，脱水剂不仅能与水混合，而且还能与包埋剂混合，这样才能保证在包埋过程中包埋剂能够渗透进组织中。

通常使用的脱水剂是一系列浓度逐渐增加的乙醇、丙酮等挥发性化学试剂。

由于脱水剂是一种很强的脂溶剂，能够溶解掉组织内的大量脂肪，因而时间要适当控制。

常用缓冲液的配制Ａ、磷酸缓冲液（0.2M）的配制方法如下：甲液：Na2HPO4.12H2O 71.64g加蒸馏水溶解成1000ml乙液：NaH2PO4.2H2O 31.21g加蒸馏水溶解成1000ml按下表混合甲、乙两液即得所需PH的磷酸缓冲液0.2M的磷酸缓冲液的配制（50ml）PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4甲液（ml）13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5乙液（ml）36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定液，并适于作灌注固定。

本缓冲液的缺点是固定时容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存。

B、二甲胂酸盐缓冲液（0.2M）甲液：二甲胂酸钠 4.28g 加蒸馏水至100ml乙液：0.2N盐酸按下表混合甲、乙两液后，将总体积稀释成200ml即可获得不同PH的缓冲液二甲胂酸钠缓冲液的配制PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4甲液（ml）50 50 50 50 50 50乙液（ml）18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7本缓冲液比较稳定，不易生长细菌，可长期保存，与低浓度的钙质（1-3mM）不发生沉淀反应。

缺点是胂有毒性、有臭味，配制时应在通风橱中进行。

（四）浸透和包埋1.浸透：就是用某种液体介质（包埋剂）渗人组织块取代脱水剂，这种介质能聚合硬化成固体，并具有足够的弹性以便进行超薄切片。

理想的包埋剂应具有以下条件：A：粘度相当低，较易渗入组织，对组织没有化学作用；B：聚合均匀而充分，聚合前后体积变化小，以保证细胞结构不受损伤；C：软硬度适中，并便于调整；D：制出的切片容易展平；E：能经得起电子束的轰击；F：高倍放大不显示本身任何细微结构；G：对胶囊没有损伤作用；H：材料来源丰富，易得、价廉，并对人体无毒性。

2.包埋的步骤：如组织块是用丙酮脱水的，在100％丙酮脱水完毕后：①先配制100％丙酮与包埋剂1∶l混合浸透液，将组织块转入此液内，室温下放置1小时；②将组织块换入纯包埋液中浸透2小时（中间可换一次包埋液）；③用牙签将组织块转移到胶囊底部或定向包埋模扳槽的顶部，然后用包埋液将胶囊或模板槽灌满，把写好标本编号的纸卷成环状放在胶囊的上部，或放在模板槽内。

④将胶囊或模板放在35－40℃温箱中浸透4小时或过夜；⑤然后放人60℃温箱48小时，使其聚合。

取出后使其自然冷却。

如用乙醇脱水时，100％乙醇后，需用环氧丙烷置换两次，每次10－20分钟，再将环氧丙烷和包埋液按1∶1混合浸透1－2小时，再进入纯包埋液。

常用的包埋剂环氧树脂配方Epon 812配方如下：甲液：Epon 812 l0mlDDSA（十二烷基琥珀酸酐）16ml（硬化剂）乙液：Epon 812 10mlMNA（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐）8.9ml（硬化剂）配制时，甲、乙液分别配制并贮存，根据不同的硬度要求，量取不同比例的甲乙液。

－般冬季用1∶4，夏季用1∶9的比例。

乙液比例越大，包埋块的性质越硬。

配好混合液后，以1.5－2％的体积比，逐滴加入DMP－30（2、4、6－三（甲氨基甲基）苯酚），充分搅拌10分钟左右，聚合温度为60℃，48小时。

这是包埋好的试样这是修块机和修整好的包埋块（五）超薄切片1.切片的准备过程①载网和支持膜：载网：常用的有铜网、不锈钢网，还有和镍、铂、尼龙等制成的载网，－般常用铜网。

支持膜：A.火棉胶膜 B.福尔瓦膜（Formvar）②包埋块的修整：制作好的包埋块，经过适当修整后，才能用于切片。

通常块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，面积为1mm2。

③制玻璃刀：2.超薄切片A.超薄切片机原理B.切片及其厚度的判断先进行厚切片或半薄切片（0.5-2u），然后超薄切片，基本上可切出500～700Å薄切片。

干涉色切片厚度暗灰色400 Å以上灰色400-500 Å银灰色500-700 Å金黄色700-900 Å紫色900 Å以上目前公认介乎于灰色和银白色的切片是比较理想的厚度，其分辨率可达25 Å左右。