1 石墨烯及氧化石墨烯在蛋白质检测中的应用 张爱红1，张 姣2,3，林虹君2,3* 1中国人民解放军防化学院，北京 102205;

2北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京 102206;

3军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

摘要：近年来，随着石墨烯的问世，石墨烯及其氧化物——氧化石墨烯在生命科学领域，尤其是蛋白质检测研究中的应用日趋增多。石墨烯以其大的比表面积、优异的生化性能使其发挥了传统材料不可替代的作用。本文综述了石墨烯及氧化石墨烯在电免疫检测、生物质谱分析以及western blotting分析中的应用，并对其应用前景做一展望。 关键词：石墨烯，氧化石墨烯，蛋白质检测

The application of graphene and graphene oxide in the detection of protein

ZHANG Ai-Hong1, ZHANG Jiao2,3, LIN Hong-Jun2,3 1Institute of Chemical Defense, Beijing 102205, China 2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing 102206, China; 3Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China Abstract: In recent years, with the advent of graphene, the application of graphene and graphene oxide in the field of life sciences, particularly in the study of protein detection is increasing. Graphene, with its large specific surface area, excellent biochemical properties, has played an irreplaceable role of traditional materials. This paper reviews the application of graphene and graphene oxide in electricity immunity detection, biological mass spectrometry and western blotting analysis, and presents its application prospect. Key words: graphene, graphene oxide, detection of protein

石墨烯(graphene)是单原子厚度的二维碳原子晶体，被认为是富勒烯、碳纳米管和石墨的基本结构单元。早在60年前人们就在理论上对石墨烯进行了研究，然而，直到本世纪初才获得独立的单层石墨。石墨烯因具有大的比表面积、优异的生物化学性能等一系列独特性质，引起了广大科研人员的极大兴趣[1,2]。然而，由于石墨烯表面功能基团较少，不易与生物分子结合，因此，首先将石墨烯氧化生成氧化石墨烯(graphene oxide, GO)，在其表面产生较多的羧基等功能基团，大大提高了其应用范围[3,4]。 1 GO的制备 GO是高结晶度的石墨经强力氧化、水解得到的产物。GO的合成方法主要有Brodie法、Staudenmaier法和Hummers法[5]。这三大化学氧化方法都是用强质子酸处理石墨，形成石墨层间化合物，然后加入强氧化剂对其进行氧化。随着研究的发展，又出现了电化学氧化法[6]，以及对以上三种化学氧化法的改进，从而缩短了氧化时间，提高了制备效率[7-10]。图1为氧化石墨烯的结构模型图。 2

图1 GO的结构模型[2] 2 石墨烯在蛋白质检测中的应用 2.1 石墨烯在质谱检测方法中的应用 石墨烯与抗体结合，扩大单位检测体系中可检测到的信号密度，可对痕量、甚至超痕量生物标志物进行检测。在2010年Dong研究组[11]首次将石墨烯应用于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)，具体操作如下：首先将石墨烯溶为基质，然后将待测小分子溶在石墨烯基质中，并对其进行检测。由于石墨烯对非极性分子的解析和离子化效率更好，因此可以提高被检测物在检测器中的响应信号。图2是MALDI-TOF MS对小分子的检测结果对比图。 从图中我们可以看出，用石墨烯作为基质时，可以大幅提高目标信号的响应度，而对干扰信号进行了规避。同时，即使目标检测物的浓度低至0.2µM时，仍能检测到明显的信号。

图2 MALDI-TOF MS检测对比图 (a)胆固醇(m/z 369, [M - H2O + H]+)和鲨烯(m/z 433, [M + Na]+)并用CHCA做基质；(b)胆固醇(m/z 409, [M + Na]+)和鲨烯(m/z 433, [M + Na]+)并用石墨烯为基质；(c)石墨烯对鲨烯的吸附量为20 µM；(d)石墨烯对鲨烯的吸附量为0.2 µM

2.2 石墨烯与氧化锆结合对含磷基团试剂进行检测 2011年Du研究组[12]又提出，将ZrO2与石墨烯结合形成graphene-ZrO2纳米复合材料(GZr)，并将GZr作为电极，用于对含磷酸基团试剂的检测(图3)。本方法对甲基对磷酸的检测线性范围是0.5~100 ng mL-1, 检测限是0.1 ng mL-1。因此，该方法可用于对有机磷试剂的监测和检测。

图3 GZr纳米电极及其对甲基对磷酸的检测示意图[12] 该方法用于对含磷酸基团试剂的检测的几个优点：1. GZr对磷酸基有强有力的结合力；2. GZr作为电极拥有快速的电子转移性能和优异的电催化性能；3. 通过电学方法可以控制待测物在GZr上的吸附量等。我们相信该方法能在磷酸肽及蛋白质的检测领域发挥重要作用。 2.3 石墨烯用于电免疫传感器对生物分子进行检测 将石墨烯应用于电免疫传感器在生物检测领域得到了较多的研究[13-16]。2010年Wang等[13]发展了一种利用石墨烯和纳米金对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记物的固定新方法(图4)。在本策略中，石墨烯首先被固定在玻碳电极上(glassy carbon electrode, GCE)，然后将L半胱氨酸(L-cysteine, L-cys)电沉积在石墨烯上。实验结果表明，石墨烯可以诱导L-cys在其表面有规律的生长，并进一步提高纳米金颗粒的稳定性，最终使得该电极负载更多的生物分子。该方法可以提高免疫传感器的灵敏度和稳定性。本传感器对人IgG的检测范围是0.2~320 ng mL-1，检测限是 70 ng mL-1，而且该结果与传统ELISA方法有较好的吻合。 3

图4 一抗的固定及免疫检测过程示意图[13] 将石墨烯用于电免疫传感器的还有Su等[14]，该研究组提出一种新的电化学免疫传感器并对人血清中的Alpha Fetoprotein (AFP)进行灵敏检测。该方法操作简便，一步即可完成免疫传感器的自组装。实验结果表明，该方法对AFP的检测动态范围是1.0~10 ng mL-1，检测限是0.7 ng mL-1。更重要的是该方法提供了一个对生物混合物检测的平台，并为其它电化学、生物化学传感器的提出及应用提供了参考。Wang等[17]利用氧化石墨烯处理过的电极，成功对小分子进行低浓度检测，体现了石墨烯优异的电学性能以及其在电化学中的应用优势。Liao等[18]

也在此领域做了相关研究。

图5 电化学免疫传感器的制备和检测过程示意图[14] 3 GO在蛋白质检测中的应用 GO由于具有较多的活化基团，易与生物分子结合，然后与蛋白质检测方法连用，可大大提高检测信号，减低现有方法的检测限(limit of detection, LOD)，扩大其应用领域。 3.1 GO与电免疫化学结合对生物分子进行检测 GO由于具有大的比表面积，可作为载体提高

对生物分子的负载量，进而达到增强检测信号的目的。早在2010年Du等[6]将GO与HRP结合，形成多酶扩增(即一个二抗对应多个HRP)，实现了对p53蛋白质的超灵敏检测(图6)。用GO改进后的方法对磷酸化修饰的p53蛋白质的检测限达到了0.01 nM，比不用GO时低了10倍，该方法的稳定性和重复性都较好，而且对人血浆中的的检测回收率达到92~103.8%。

图6 HRP-p53392Ab2-GO的制备过程[6] 在同一年，该研究组又提出将石墨烯和碳纳米球用于免疫传感器，实现双重信号放大[8]。该方法将功能化的石墨烯片用于传感器平台，增加其与初级抗体(Ab1)的结合能力，实现了对信号的放大。实验结果表明，改进后的方法对癌症标志物AFP检测信号提高了7倍，检测限可达0.02 ng mL-1，线性校正范围是0.05~6 ng mL-1。因此，该方法为临床筛查癌症生物标志物提供了新的选择。此外，Chen等[19]对石墨烯的制备、功能化修饰以及其在电化学方面的应用等做了很好的综述。 3.2 GO与磁性Fe3O4结合 He等[20]利用两步法完成了GO和表面修饰过的Fe3O4的结合。具体步骤是：首先，用四乙基正硅酸盐和(3-氨丙基)三乙氧基硅烷在Fe3O4表面引入氨基，然后，Fe3O4上的氨基与GO上的羧基反应，生成GO-Fe3O4结合物，该结合物对亚甲基蓝和中性红的阳离子染料的吸附量分别为190.14 mg g-1 和140.79 mg g-1，而且GO-Fe3O4可以用NaBH4

还原得到graphene-Fe3O4。GO-Fe3O4的制备过程见

图7。