第三节动物的克隆1.幼龄动物组织用胰蛋白酶处理――――――――→细胞悬浮液―→原代培养―→传代培养。

2．细胞株与细胞系(1)细胞系：原代培养细胞首次传代时就成为细胞系。

分为有限细胞系和连续细胞系两类。

(2)细胞株：从原代培养物中或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称细胞株。

也分为有限细胞株与连续细胞株。

3．克隆培养法把一个细胞培养为一个新的细胞群体的技术叫克隆培养法。

这样培养获得的细胞群叫纯系。

4.培养条件⎩⎪⎨⎪⎧无菌、无毒的环境营养需要：适宜的培养基、添加血清、激素胰岛素、CO2气体环境、调节pH及滋养细胞等条件1．把动物组织块分散成单个细胞所用的胰蛋白酶能否换成胃蛋白酶？【提示】不能。

因为胃蛋白酶的最适pH呈酸性，环境不适合。

2．为什么细胞系或细胞株中有些细胞可无限传代？这些细胞为癌细胞吗？【提示】这些细胞往往有异倍体核型，使其能够无限传代。

能够无限传代的细胞有的仍保留接触抑制现象，一般不是癌细胞。

⎩⎪⎨⎪⎧⎭⎪⎬⎪⎫B 淋巴细胞能产生抗体骨髓瘤细胞能无限增殖――――――→用灭活的病毒诱导细胞融合并筛选 多种杂种细胞――→细胞培养筛选能产生专一抗体的且可无限增殖的细胞群。

2．单克隆抗体的获得⎩⎪⎨⎪⎧ 体外培养：从细胞培养液中提取抗体体内培养：从动物腹水中提取抗体3．应用在疾病诊断、治疗与预防方面与常规抗体相比具有特异性强、灵敏度高的特点。

单抗可作为特异探针，研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能。

3．单克隆抗体生产中两次筛选的目的有何不同？【提示】 第一次筛选为了选出杂交瘤细胞，第二次筛选是从杂交瘤细胞中选出能产生单一抗体的杂交瘤细胞。

1.过程2．动物克隆成功证明了(1)高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。

(2)在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核(包括异源细胞核)发育的作用。

3．克隆的意义(1)为遗传病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途径。

(2)对物种的进化、濒危动物的保存及对转基因动物的扩群有重要意义。

(3)丰富了人们的物质生活。

(4)缩短育种年限，提高生产效率。

1．细胞株是具有特殊性质(如病毒敏感性、生化特性)的细胞系。

(√)2．有限细胞系易于克隆。

(×)【提示】 有限细胞系不易克隆。

相反，无限细胞系易于克隆。

3．动物细胞杂交可利用物理、化学方法进行介导。

(√)4．制备单克隆抗体时使用的免疫细胞为T 淋巴细胞。

(×)【提示】 应为B 淋巴细胞。

5．“多莉”的性状与提供乳腺上皮细胞的6岁母羊完全相同。

(×)【提示】“多莉”的性状酷似6岁母羊。

6．低等动物的全能性一般较易体现。

(√)①动物细胞培养的具体过程如何？动物细胞培养与植物组织培养主要有什么区别？②什么是原代培养？什么是传代培养？分别有什么特点？③细胞株和细胞系有何区别与联系？1．过程动物组织块――→胰酶等分散成单个细胞―→制成细胞悬液―→原代培养―→接触抑制――→胰酶等传代培养(1)胰酶的作用：消化细胞间的蛋白(主要为纤维蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性纤维等)，使组织分散成单个细胞。

(2)原代培养与传代培养：从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养。

原代培养的细胞生长、繁殖一定的时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行分瓶扩大培养，即传代培养。

(3)细胞株与细胞系①含义：条件合适时，能连续传代的细胞称为细胞系。

通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株，细胞系细胞的遗传物质若发生了改变，具有癌细胞的特点。

细胞株一般具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和生化特性等。

②图示：(3)细胞贴壁和接触抑制悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。

细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

当细胞癌变后，就失去接触抑制的特点，而无限增殖。

动物细胞培养的结果1．连续细胞系：能连续培养下去的细胞系。

是发生转化了的细胞系，大多数具有异倍体核型。

有的是恶性细胞系，具有异体致瘤性；有的连续细胞系获得了不死性，但保留接触抑制现象，不致癌。

2．有限细胞系：不能连续培养下去的细胞系。

二倍体细胞一般为有限细胞系。

3．连续细胞株：可连续多次传代的细胞株。

4．有限细胞株：可传代次数有限的细胞株。

2．应注意的问题(1)动物细胞培养时可以分散成单个细胞，也可以用细胞群(团)、组织块培养。

分散成单个细胞后培养，细胞易获得所需的营养物质，其代谢废物容易排出；同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。

(2)为了保证细胞培养时满足其营养物质和生长因子的供给，培养基中添加一定量的血清，因为血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素及一些未知的营养物质。

(3)由于大多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，而胃蛋白酶发挥活性的最适pH为2.0左右，因此不能使用胃蛋白酶使细胞分散开。

3．动物细胞培养技术的应用(1)生产病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素等。

(2)利用动物细胞培养技术中的细胞贴壁生长和接触抑制的特点，可用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞，以供植皮所需。

(3)培养的动物细胞用于检测有毒物质，判断物质的毒性。

区分原代培养和传代培养原代培养和传代培养一般均需对细胞进行胰蛋白酶分散处理，区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。

1．第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，分散后培养，即为原代培养。

2．第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，分散到多个培养瓶中继续培养，即为传代培养。

某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。

供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞、乙细胞为正常肝细胞。

请回答下列有关动物细胞培养的问题。

(1)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同。

一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量________。

(2)在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是_______________________________________________________。

细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是___________________。

(3)在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长________。

药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更________。

若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需要________处理。

(4)为了防止细胞培养过程中细菌的污染；可向培养液中加入适量的________。

【审题导析】由题干可获取的信息有：(1)试验材料是肝细胞。

(2)肝细胞有两种，一种是肝肿瘤细胞，一种是正常的肝细胞。

解答本题时需明确动物细胞培养的过程、条件及应用，再结合每小题作答。

【精讲精析】癌细胞具有无限增殖的特点，故相同培养条件下，肝肿瘤细胞数量多于正常肝细胞数量。

动物细胞培养需提供无菌环境，如向培养液中加入适量的抗生素可防止细菌的污染；需提供一定的营养，如向培养基中加入适量血清，以便补充合成培养基中缺乏的物质；需提供一定的气体环境，如向恒温培养箱中加入5%的CO2，目的是维持培养液的pH。

【答案】(1)多(2)血清可以补充合成培养基中缺乏的物质维持培养液的pH (3)停止多胰蛋白酶 (4)抗生素下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( )A．培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞B．克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变C．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的D．恶性细胞系的细胞可进行传代培养【审题导析】解答此题的关键必须明确二倍体核型的体细胞为有限细胞系，而异倍体核型细胞如恶性细胞系的细胞属连续细胞系。

【精讲精析】有接触抑制的细胞只能形成单层细胞；克隆培养法培养的细胞可以是细胞株(遗传物质并未改变)；二倍体细胞形成的是有限细胞系，传代次数有限；恶性细胞系为无限细胞系可以传代培养。

【答案】 D①动物体细胞核移植技术的原理和过程是怎样的？②克隆动物的应用前景是怎样的？③体细胞核移植技术属于百分之百的克隆吗？1．动物核移植的概念将一种动物的细胞核移植到去核的卵母细胞中，并发育成新个体的方式。

2．核移植过程3．图例：4．核移植特点主要是指不同种的细胞的拆合，新个体主要具备供核亲本的遗传特性。

5．动物体细胞核移植技术的应用(1)畜牧生产方面：培育良种动物。

(2)保护濒危物种。

(3)医药卫生方面：生产医用蛋白、器官和组织等。

6．动物体细胞核移植技术存在的问题(1)成功率低。

(2)克隆技术的各个环节有待进一步改进。

(3)克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷。

克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA。

所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是对供核动物的完全相同的复制。

此外，即便动物的遗传物质完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。

“治疗性克隆”将是人胚胎干细胞(简称ES细胞)造福于人类的一种非常重要的途径。

应用人胚胎干细胞进行“治疗性克隆”研究的技术途径包括以下几个步骤：首先取病人的体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞中；在早期胚胎形成后，从中分离获得ES细胞；对ES细胞进行基因修饰和定向分化研究，将定向分化后的细胞移植给病人。

进行核移植的目的并不是用于克隆人，而是希望通过对ES细胞进行分离培养、定向分化等处理后，进一步获得再造的人体组织或器官。

请根据材料回答下列问题。

(1)人类“治疗性克隆”属于动物细胞工程的________________技术。

(2)科学家为何要将患者的体细胞核植入去核的卵母细胞中，而不直接用体细胞进行细胞培养？_____________________________________________________________________________________________________________。

(3)“治疗性克隆”的结果说明高度分化的体细胞的细胞核仍然具有________。

相同的胚胎干细胞，“克隆”的结果各种各样，如有的是胰岛细胞，有的是血细胞，有的是心肌细胞，究其本质原因是基因____________的结果。

(4)克隆的器官在给自身移植方面的主要优点是_____________________。