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胡杨和灰杨的组培体系
条件摸索
1.初步摸索
胡杨
过程 叶片愈伤
诱导
生芽
培养及配方
MS+ 1mg/L IAA+0.02mg/L TDZ
MS+0.1mg/L 6-BA+0.005mg/L TDZ+1mg/LNAA
MS + 0.5mg/L IAA + 0.05mg/L 6-BA
生根
1/2 MS+1.5mg/L IBA
ddH20
卡那霉素 kanamycin，Kan
乙酰丁香酮 （酚类）
acetosyringone，AS
头孢霉素 cephalosporins ，Cef
ddH20 甲醇 ddH20
利福平
rifampicin，Rif
甲醇
0.22 um滤膜过滤 0.22 um滤膜过滤 0.22 um滤膜过滤 0.22 um滤膜过滤 0.22 um滤膜过滤
4.诱导丛生芽
将边缘长出愈伤组织的外植体转移到含0.1mg/L NAA +2.0mg/L ZT+ 400mg/L Cef + 9mg/L Hyg的生芽培养基上，25℃光照培养。每隔7～ 10d更换培养基一次,待愈伤组织生出丛生芽。
5．生根培养
培养筛选的抗性芽长1～1.5cm时，从基部将芽切下，并转入含有 0.1mg/L NAA + 400mg/L Cef + 9mg/L Hyg(或者50mg/L Kan）的生根培 养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。
细胞分裂素类：
激动素（KT）、6-苄基嘌呤（ 6-BA）、玉米素（ZT）
培养基配方，培养条件
过程 预培养 共培养
培养基 MS MS
激素 200μM AS
抗生素（转化实验）
光条件 黑暗 黑暗
愈伤培养 生芽培养 生根培养
MS 1/2 MS 1/2 MS
0.025mg/l 6-BA +0.5mg/l TDZ 200mg/l Cef
2) 用无菌滤纸将叶盘表面多余水分吸干，正面朝上平铺于MS培 养基中，封口置于黑暗环境中培养1天，用于转化
2.农杆菌活化
—— 侵染前3~4天进行
• 抗性培养基：LB +50mg/l rif +50mg/l str +为25获m得g/较l k好an的划单板克技隆巧，：用白枪头轻
• 生长条件：28℃
轻蘸取菌液，先在平板上平行划线， 更换枪头后再交叉划线，单向划线
0.1mg/l 6-BA +1.0mg/l IBA 1.0mg/l IBA
200mg/l Cef+25mg/l Kan 200mg/l Cef+25mg/l Kan
黑暗 光照 光照
实验流程
后续试验
打叶盘，预培养1d
农杆菌活化
浸泡法侵染叶盘，共培养3d
愈伤培养~10d 生芽培养 >20d
炼苗移栽
生根培养~2周
2. 外植体的侵染及共培养
1）取杨树无菌叶片，切成4～6mm的叶盘到无菌瓶中
2）加入重悬菌液，感染10min，期间间隔3～5min轻微振荡
3）取出外植体用无菌吸水纸吸去附着的菌液，接种在共培养基上，暗培 养36~48h。
3．诱导愈伤组织
将共培养的外植体转移到含1.0mg/L NAA +2.0mg/L ZT+ 400mg/L Cef + 9mg/L Hyg的选择培养基上，25℃暗培养诱导愈伤。约10d外植体长出 愈伤组织。
• pH • 温度 • 湿度 • 光照
培养基PH值~ 5.85 温室温度~25℃ 湿度30~40%
16h light / 8h dark
各种抗生素配方
注意：AS和Rif也可用DMSO溶解，因 高浓度DMSO可溶解滤膜，需要用油
膜进行过滤除菌，且速度很慢
名称
英文名
溶解试剂
除菌
保存
现有浓度
氨苄青霉素 ampicillin，Amp
5.生根培养
• 待芽分化并长至~2cm时，从基部将芽切下（避免带有愈伤组 织，影响生根），转入含cef （200mg/l）和Kan （25mg/l） 生根培养基上，光照培养诱导生根，获得具有抗性的转基因 阳性植株
6.炼苗移栽
• 待无菌苗在培养瓶中长到~10cm时，需将其移至温室环境的土壤中培养 1）炼苗：先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间环境中适应生长几
日。 2）清洗移栽：用流水清洗掉根部的培养基，移栽到土壤中（土壤应提前
一天吸水） 3）移栽后管理
幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥
西南大学的体系
• 植物材料：新疆杨无菌苗
• 农杆菌：根癌农杆菌EHA105(LBA4404)
•
根癌农杆菌GV3101
• YEP培养基：蛋白胨(10g/L )、酵母提取物(10g/L )、Nacl(5g/L ) PH=7.0 • WPM重悬液：WPM+30g/L蔗糖+100μmol/L AS （PH=5.82-5.87）
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新疆杨转基因体系
• 学名:新疆杨 • 分类：杨柳科，杨属 • 抗盐抗旱性较弱，可作为研究胡杨抗逆基因的参照
实验材料
• 材料：新疆杨 • 农杆菌菌种：根癌农杆菌LBA4404—利福平（rif）和链霉素
（str）抗性 • 表达载体：pBib-basta-35S-GFP（含Kan抗性基因）
杨树生长条件
数不可过多，可获得稀疏分布的单
• 二次活菌：
克隆菌株
1）取-80 ℃保存的农杆菌划板, 28℃ 倒置培养，约36~48h长出单克隆
2）挑单克隆接种于30~50ml LB抗性培养基中，200r、28 ℃摇菌24h （一活）
3）将活化的菌液按1:100~1:50接种到50ml LB抗性培养基中，培养10~14h， 至OD600值达到0.3~0.7（0.6为最佳） ，用于侵染实验（二活）
1.叶盘预培养
—— 侵染前1天进行
• 材料：新疆杨无菌苗 • 灭菌准备：MS（s）培养基，培养皿，滤纸，打孔器，滤纸，蒸馏水，
镊子，剪刀 • 叶盘大小：直径0.5~1.0cm（叶盘过小会增加诱导愈伤的难度）
1) 选取生长旺盛的新疆杨无菌苗，取茎上段新鲜幼嫩的叶片， 置于盛有无菌水的培养皿中，用打孔器将其打成圆盘，避 开主叶脉和叶缘
• 共培养培养基： WPM+30g/L蔗糖+100μmol/L AS+1.0mg/L NAA +2.0mg/L ZT+8.0-8.2g/L琼脂 （PH=5.82-5.87）
• 愈伤培养基： WPM+30g/L蔗糖+9mg/L Hyg(或50mg/L Kan）+1.0mg/L NAA +2.0mg/L ZT+ 400mg/L Cef +8.0-8.2g/L琼脂 （PH=5.82-5.87）
2）将活化过夜的农杆菌按1：100～1：50的比例接种在相同的20-50ml YEP液体培养基中，继续培养至OD600为0.2～0.4。
3）将二活的农杆菌菌液加入50ml离心管中5000rm离心10min，去上清， 加入50mlWPM重悬液（含AS），移入圆口瓶中，在28℃，200rpm振荡 培养1～2h。
配制方法 少量（50ml中约10ml）乙醇溶解后，加水稀释 0.1M HCl（或乙醇）溶解后加水稀释 1M HCl溶解后加水稀释 1M NaOH 溶解后加水稀释 乙醇或氢氧化钠溶解后加水稀释 1M HCl溶解后加水稀释
保存
4℃ 避光 保存
生长素类：
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）
2. 载体介导法
• 农杆菌介导法（双子叶 植物）
• 病毒介导法
农杆菌介导法
• 根癌农杆菌 • Ti质粒（Tumor-inducing plasmid）为根癌农杆菌染色体外的遗传物质
可诱导被侵染的植物细胞产生肿瘤，即诱发冠瘿瘤。 • Ti质粒包括毒性区(Vir区)、接合转移编码区（Con区）、复制起始区(Ori区)和T-DNA
Ti质粒介导转化的过程
1) 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位 2) 受酚类物质（AS，乙酰丁香酮）的诱导，vir区基因被激活，
virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB 序列切出单链切口，释放T-DNA的单链线性拷贝（T-链） 3) T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁， 进入植物细胞壁并整合到植物染色体基因组中 4) T-DNA 在植物细胞内表达
• PS：WT新疆杨在wpm生根培养基中生长较快，在MS生根培养基中生长较好。两 种生根培养基都可以不加任何激素，也可以加入0.1mg/L NAA,促进生根。
1. 农杆菌活化
1）挑取单菌落，接种在30～50mlYEP液体培养基中，28℃，200rpm振 荡培养过夜,直至对数生长OD600为0.6～0.8。
灰杨
叶片愈伤 诱导
生根
MS + 0.5mg/L IAA + 0.05mg/L 6-BA
1/2 MS+1.5mg/L IBA
生长时间
1~2个月诱导出愈 伤组织
30天左右从愈伤组 织长出小芽
可诱导出愈伤，并继续扩大培养
长出的芽叶组织较厚重，降低细胞 分裂素之后此现象减弱
可诱导出不定芽
2~3周长出白色毛 状根
分装，－20℃保存 分装，－20℃保存 分装，－20℃保存 分装，－20℃保存 分装，－20℃保存
50mg/ml 50mg/ml
100mM 200mg/ml
20mg/ml
•所有抗生素均在培养基灭菌后温度低于60℃时加入