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编号：2-2

主题：第二代DNA测序技术

概述：
第一代测序（缺点：通量低1000个核苷酸/反应，费用高）
• 化学降解法
• 双脱氧链终止法（Sanger法）
• 荧光自动测序技术
• 杂交测序技术
高通量测序：
第二代测序（next-generation sequencing，NGS）

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通
过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括
Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied
Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段
比较长，高质量的读长(read)能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机
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器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只
有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于
99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序
技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来
完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，
下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技
术的基本原理、操作流程等方面。

原理：
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在
Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同
的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同
的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测
DNA的序列信息。

Illumina Solexa测序仪特点：
• 桥式PCR
• 边合成边测序
• 可逆终止物
Illumina Solexa 测序流程：
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操作步骤：
1)测序文库的构建(Library Construction)
首先准备基因组DNA(虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome
Analyzer系统所需的样品量可低至100ng，能应用在很多样品有限的实验
中)，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定
的接头(Adaptor)。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片
段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然
后再片段化并加上接头。片段的大小(Insert size)对于后面的数据分析有影响，
可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert
size，以便在组装(Assembly)的时候获得更多的信息。