主堡塞堕塑Ｉ堕座疸垂堂盘查！！！！笙！！旦箜！！鲞筮！塑曼！也！苎！垦！Ｐ堡！！！！坐！！Ｑ！！！！竺！！！！！！！！：！！！盟！：！Ｓａｎｇｅｒ法测定季节性Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒全基因组序列
李希妍赵翔谭敏菊蓝雨成艳辉黄维娟王大燕舒跃龙１０２２０６北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心卫生部医学病毒和病毒病重点实验室通信作者：王大燕，Ｅｍａｉｌ：ｄａｙａｎｗａｎｇ＠ｃｎｉｅ．ｏｒｇ．ｏｎＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９２７９．２０１６．０５．０１３
【摘要】目的对流行的季节性甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒进行全基因组测序。方法本文对甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒测序过程中的ＰＣＲ扩增引物进行优化及精简，同时对ＰＣＲ产物纯化方法进行了改进。使用优化后的３４对ＰＣＲ引物和优化后的纯化方法，对１９４株甲型Ｈ３Ｎ２亚型病毒进行了测序。结果利用优化后的测序方法，可保证获得甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒的８个片段全基因组序列，而且大大缩短了实验时间，节约了实验成本和人力。结论我们应大力开展Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒的序列测定工作，及时发现病毒变异情况，以推选出与人群中的流行株更为匹配的疫苗株。【主题词】流感病毒；Ｈ３Ｎ２亚型；测序；全基因组基金项目：国家科技重大专项“Ｈ７Ｎ９等新型流感病毒跨种传播机制研究”（２０１４ＺＸｌ０００４００２—００１－００３）
ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｓｅａｓｏｎａｌｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓＬｉＸｉｙａｎ，ＺｈａｏＸｉａｎｇ，ＴａｎＭｉｎｊｕ，ＬａｎＹｕ，Ｃｈｅｎｇ
Ｙａｎｈｕｉ，ＨｕａｎｇＷｅ咖ａｎ，ＷａｎｇＤａｙａｎ，ＳｈｕＹｕｅｌｏｎｇＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＶｉｒａ２ＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ
ＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ；ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＮａｔｉｏｎａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＦａｍｉｌｙＰｌａｎｎｉｎｇＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１
０２２０６，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷａｎｇＤａｙａｎ，Ｅｍａｉｌ：ｄａｙａｎｗａｎｇ＠ｃｈｉｃ．ｏｒｇ．ｃｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｏｆｓｅａｓｏｎａｌ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓ．
ＭｅｔｈｏｄｓＯｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｏｆＡ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓ，ａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｕｓｅｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ，１９４
Ａ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓ
ｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．ＲｅｓｕｌｔｓＯｐｔｉｍｉｚｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｆｕｌｌｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓ，８ｓｅｇｍｅｎｔｓｏｆａｌｌＡ
（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｉｓ
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Ｎ２）
ｖｉｒｕｓｅｓ，ｔｏｔｉｍｅｌｙｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄｔｏｓｅｌｅｃｔｍｏｒｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ；Ｈ３Ｎ２
Ｓｕｂｔｙｐｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅ
Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭａｊｏｒＰｒｏｊｅｃｔｏｆＣｈｉｎａ（２０１４ＺＸｌ０００４００２－００１－００３）
甲型Ｈ３Ｎ２［Ａ（Ｈ３Ｎ２）］亚型流感病毒于１９６８年引起了全球范围的流感大流行，此后一直在人群中呈季节性流行。对流感病毒表面蛋白ＨＡ基因的分析表明，与人群中流行的其他季节性流感病毒相比，Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒的进化和变异最为迅速¨１。流感病毒是分节段的ＲＮＡ病毒，对流感病毒全基因组８个基因片段的综合分析，可以进一步全
４６９．短篇论著
面揭示流感病毒的重配和变异规律。既往有研究者曾公布Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒测序引物，本实验室对此方法进行了优化，可在１０ｈ左右快速获得Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒的全基因组序列，可用于流感病毒的日常监测和研究工作，及时进行病毒进化分析。
万方数据１材料与方法主堡塞堕塑！堕鏖疸壹堂盘查！！！！至！！旦箜！！鲞箜ｉ塑垦！！！！苎』垦翌鱼！ｉ！！ｉ竺！：Ｑ！！！！竺！！！！：！！！：！！：盟！：１
１．１毒株来源本研究的Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感毒株均为国家流感中心保存，病毒分离时间自２０１０年１月至２０１５年１０月。１．２病毒ＲＮＡ的提取及基因扩增利用Ｑｉａｇｅｎ公司ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ试剂盒进行ＲＮＡ提取。从网站ｈｔｔｐ：／／ｇｓｃ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｍｓｃ／ｉｎｎｕｅｎｚａ选取人甲型Ｈ３Ｎ２亚型扩增引物，再根据后续测序反应结果进行引物优化。所有测序引物由大连宝生物公司合成。使用Ｑｉａｇｅｎ公司ＯｎｅＳｔｅｐＲＴ—ＰＣＲＫｉｔ进行基因扩增，反应体系为１０¨ｌ。具体操作方法参见试剂盒说明书。ＰＣＲ反应条件为６０ｏＣ１ｍｉｎ；４２℃２０ｍｉｎ；５０ｏＣ２０ｍｉｎ；９５ｏＣ１５ｍｉｎ；９４℃３０Ｓ，５５℃３０Ｓ，７２℃１ｍｉｎ，循环３５次；７２ｏＣ１０ｍｉｎ；４ｏＣ保存。１．３ＰＣＲ产物纯化及序列测定ＰＣＲ产物纯化分别使用Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡｑｕｉｃｋ９６ＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ和ＵＳＢ公司的ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ，两种方法进行比较。测序反应使用美国ＡＢＩ公司的ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ。由于ＰＣＲ引物已包含Ｍ１３接头，因此用于测序反应的引物为通用引物Ｍ１３。具体方法参见文献［２］。１．４序列分析序列拼接采用ＤＮＡＳｔａｒ软件中的Ｓｅｑｍａｎ程序。序列比对使用ＭＥＧＡ５．０软件的ＣｌｕｓｔａｌＷ方法。２结果２．１纯化方法优化最初使用Ｑｉａｇｅｎ公司的ＱＩＡｑｕｉｃｋ９６ＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ滤膜法进行ＰＣＲ产物纯化，每纯化９６个反应约４０ｍｉｎ，如果样品量增多，所需的纯化时间将加倍。改进实验方法后，使用ＵＳＢ公司的ＥｘｏＳＡＰ—ＩＴ虾碱酶纯化，此纯化方法在加入虾碱酶后可用ＰＣＲ仪进行热反应，无论样品量多少，只需３０ｍｉｎ即可完成纯化。因此更换试剂后，更加节省时间及人力。２．２引物匹配性优化使用８９对ＰＣＲ引物对Ａ（Ｈ，Ｎ：）亚型流感病毒进行全基因组测序，共测序毒株３２０株，采样日期为２０１０年１月至２０１４年５月。在实验过程中，发现部分病毒未能通过一次测序实验而获得全基因组序列，个别引物在对这些病毒进行序列测定时不工作。为了确保所有病毒序列能够一次测通，对引物序列进行了优化，使用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件，根据已知病毒序列，设计并更换了４对引物，分别为ＰＢｌ．５、ＰＢｌ—７、ＰＢｌ－８和ＰＡ－１１。
２．３引物数量优化用８９对引物对Ａ（Ｈ，Ｎ：）亚
型流感病毒进行ＰＣＲ反应，再使用通用引物Ｍ１３分别进行正反向测序反应，最终获得１７８条序列，拼接后发现，每一核苷酸位点有４至９个测序反应。为了节约成本，能够在最短时间内完成全基因组测序工作，对测序所使用的ＰＣＲ引物进行精简。最终确定了３４对引物，扩增的目的片段之间相互重叠，能够覆盖整个流感病毒全基因组。２．４引物验证使用筛选出的３４对引物对采样日期在２０１４年３月至２０１５年１０月之间的１９４株Ａ（Ｈ，Ｎ，）亚型流感病毒进行测序，结果表明仅使用此３４对引物，可以完成流感病毒所有８个片段的全基因组测序，显著减少了实验成本和实验时间。
３结论近年来，下一代测序（Ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎ－
ｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术相继出现并迅速发展成熟。ＮＧＳ以高通量、低成本为主要特点¨。，不过，由于ＮＧＳ技术相关的仪器费用较高，不利于广泛推广。而１９７７年Ｓａｎｇｅｒ发明的双脱氧末端终止法，即第一代测序技术，拥有较长读长（平均读长７００ｂｐ）和
极高准确率（９９．９％）‘４１，对于少量测序仍是最佳选择。目前有些实验室已有第一代测序平台，但是缺乏有效的测序引物，不能得以充分利用，所以我们希望共享我们优化后的测序方法。使用经过我们优化的测序引物对Ａ（Ｈ３Ｎ２）流感病毒进行测序，其匹配性更高，而且大大减少了ＰＣＲ扩增的数量，可以节约成本。流感病毒抗原性易变，传播迅速，每年可引起季节性流行，并且在人群聚集的场所可发生暴发疫情。对孕妇、婴幼儿、老年人和慢性病患者等高危人群的危害尤为严重，接种流感疫苗是目前预防流感、降低流感疾病负担最有效的手段¨１。由于流感病毒易发生抗原性漂移和抗原性转变，而目前全球已上市的流感疫苗都不能克服流感病毒易于变异的特点，影响疫苗免疫效果的主要因素
万方数据