实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。

二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。

本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。

2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。

3.温度计（0～100℃）。

4.微量滴定管5ml（×1）。

5.容量瓶1000ml（×1）。

四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。

2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。

3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。

4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。

5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。

6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。

各瓶时间达5min时立即加 2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。

用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。

六、计算分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。

[S]=c1V1/10式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；V1：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；υ：反应速度（m mol/min）；c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；V2：KMnO4体积（ml）；以1/υ对1/[S]作图求出Km。

实验二酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。

二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。

它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。

酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。

以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。

在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。

即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。

而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。

可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。

进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。

从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。

随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。

要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。

三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A在0.6～0.7之间。

405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。

（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。

四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。

长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。

然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。

将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。

2.酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。

各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。

然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。

立即摇匀并开始计时。

按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。

待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。

冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP 后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光值。

度计上测定各管A4053.数据处理值为纵坐标绘制进程曲线。

由进程曲线中直线部以反应时间为横坐标，A405分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、目的：了解酶的纯化方法。

二、原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。

（请参考相关教材）三、试剂与仪器1、试剂与材料：(1)干酵母(2)石英砂(3)1 mol/L醋酸溶液(4)2 mol/L氢氧化钠溶液(5)醋酸缓冲液（pH 4.6）(6)5% 蔗糖溶液(7)D NS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。

四、操作方法1、破碎细胞取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20 min（研磨液面上刚出现冰结为宜）。

取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心取出上清液（组分一）并量出体积V，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余1者倒入三角瓶。

2、纯化把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）。

然后迅速放入到55 ℃的水浴中，保温30 min。

之后在冰浴中迅速冷却。

在5000 r/min条件，分别取0.5 ml上清液到下离心12 min。

取出上清液（组分二）并量出体积V2试管C、D中。

3、酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物：试管中反应物在55 ℃水浴中反应5 min（秒表计时）后，B、D管立即．．各加入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，A、C管中各加入1 ml蒸馏水。

4、酶催化产物检测取5支试管，分别加入反应物：试管中反应物在沸．水浴中反应5 min，然后冷却。

加入4 ml蒸馏水。

将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540。

五、结果计算1、酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55℃条件下，每1 min 催化底物转化为1 mg 还原糖的酶量。

2、酶活计算：粗酶的计算酶活（组分一）：5.05.45545)(⨯⨯⨯-ABS ABS A B 纯化后酶的计算酶活（组分二）：5.05.45545)(⨯⨯⨯-ABS ABS C D3、总酶活的计算：总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活×稀释倍数⎪⎭⎫⎝⎛5.01V总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活×稀释倍数⎪⎭⎫⎝⎛5.02V4、酶活回收率的计算：酶活回收率 = %10012⨯总酶活总酶活附：还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

实验四蔗糖酶包埋及固定化酶活测定一、目的：了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。

二、原理：海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从而把酶包埋在其中。

（请参考相关教材）三、试剂与仪器1、试剂与材料：(8)干酵母(9)海藻酸钠(10)无水氯化钙(11)5% 蔗糖溶液(12)DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。

四、操作方法4、配A液取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。