#论 著#8-9个月SD 大鼠小胶质细胞的纯化分离培养耿 慧 钟 远=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。
方法以M cCarthy 的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b 免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。
结果 培养的8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。
结论 8-9个月SD 大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。
=关键词>小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病中图分类号:R 331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2010)02-0152-03The pr i m ary cu lture m e thod for isolation of m icrogli a fro m 8-9m on th rats GE N G H u i ,Z H ONG Yuan .D epart m entof G e ronti s m,the S i x t h P eop le s 'H osp ita l o f Shangha i Ji ao t ong U n i ve rs i ty ,Shangha i 200233,Ch i na Correspond i ng au thor : ZHONG Y uan ,Ema i:l zhongyuan60@yahoo =Abstract > O bjective T o se t up an easy and e ffecti ve m ethod for pr i m ary cu lti vate and pur ifi cation of the m i crog lia cells .M eth odsBased on class i ca lm i crog li a pri m ary cu lture m e t hod o fM cCa rt hy ,and w e i m proved th i sm ethod .In the l a ter pur ifi cation phase o f ce ll cu lti va tion ,m i crog lias w ere parall y ope ra ted and culti v ated w ith m echan ical separa ti on m ethod .M orpho log i c changes and the nu mber of ce lls were reco rded under the sa m e m agn ifi ed fi e l d o f scope .The acti v ity and t he pro liferati on w ere exam i ned by C ell Counting K it .R es u lts P resen t m od ifi edm ethod stead ily produced m icrog li a from 8-9m ont h SD rat w ith hi gh pur it y.N o sign ificant pro lifera ti on w as found i nnor m a l cu lt ura l cond iti on .Con clusi onThe m i crog lia ce lls i solated from 8-9m ont h SD rat can a lso be cu lti vatedsuccessfull y i n v itro ,prov i ding a basis f o r furt her research o f the m icrog lia i n A l zhe i m er d i sease .=K ey words >M icrog li a ;Ce ll culture ;A g i ng ;A lz he i m er s 'disease作者单位:200233上海,上海交通大学附属第六人民医院老年科通信作者:钟远,Em ai:l z hongyuan60@yahoo .co 小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞,大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10%。
研究表明,小胶质细胞与脑外伤、脑肿瘤、脑缺血、阿尔茨海默病(A lzhei m er s 'd isease ,AD)、帕金森病与实验性自身免疫性脑脊膜炎等中枢神经系统疾病有关。
小胶质细胞的纯化分离培养对于离体条件下进行小胶质细胞的实验研究具有广泛的实用价值。
但由于其细胞数目所占比例较小,在体外较难分裂增殖,研究多采用新生大鼠源性的小胶质细胞。
但是已有研究证实新生鼠源性的小胶质细胞在很多生物学特性上跟成年鼠的小胶质细胞有很大的差别。
为了深入研究小胶质细胞在阿尔茨海默病等老化相关性疾病中的作用,本文以M c Carthy 的方法为基础并加以改进,在体外成功培养成年SD 大鼠源性的小胶质细胞,为小胶质细胞在增龄性疾病中作用的研究奠定了基础。
材料和方法一、实验动物和试剂1.实验动物成年SD 大鼠(8-9月龄),上海实验动物中心提供。
2.试剂D ME M /F12高糖培养基(含双抗,青霉素100U /m ,l 链霉素100U /m l),胰蛋白酶(G I BCO 公司),优质胎牛血清(H yclone 公司),小鼠抗大鼠CD11b 单克隆抗体,DAB 显色试剂盒(武汉博士德公司),CCK-8试剂盒(日本同仁化工)。
二、实验方法1.混合胶质细胞培养8-9月龄SD 大鼠无菌条件下开颅取脑,取两侧大脑半球用冷D-H anks 溶液清洗并仔细剔除脑膜及血管,钳取皮质并充分剪碎(约0.5@0.5@0.5mm大小,尽量细碎);用抛光后的吸管轻轻吹打,使其成细胞悬液,加入0.125%胰蛋白酶2m l并置于37e培养箱内消化15m i n;加入15m l D ME M/F12完全培养基(10%胎牛血清,双抗)终止反应,再次用抛光成口径为1mm的吸管轻轻吹打20次,静止10分钟待组织下沉后,将细胞悬液移入另一新的离心管;再加入15m l DME M/F12完全培养基至剩余组织中,抛光吸管稍用力吹打,再让组织下沉,收集细胞悬液;重复上一步骤2~3次,将收集的细胞悬液用200目筛网过滤;过滤后的细胞悬液用50m l离心管分装,1000rpm离心10m in;弃上清,用含20%胎牛血清的D M E M/F12培养基重新悬浮细胞,胎盼蓝染色计数活细胞数量,调整细胞浓度为1@106 cells/m l接种至50m l一次性培养瓶中;置37e、5% CO2培养箱中培养。
2.小胶质细胞纯化分离上述混合培养的胶质细胞在培养箱中培养48h后全量换液(10%胎牛血清);次日置于37e恒温摇床中以250r/m in振速摇动处理2h,收集摇晃下来的细胞悬液并接种到另一50m l培养瓶中,37e、5%CO2培养箱中培养1h,弃去未貼壁细胞,获得的细胞即为纯化的小胶质细胞;胎盼蓝染色检测活细胞数目。
3.小胶质细胞培养分离纯化培养的小胶质细胞以2000cells/w ell的密度接种于96孔培养板,以4@104/c m2接种于预先埋植盖玻片的30m l培养皿中,加入含10%胎牛血清的D M E M/F12培养基继续培养,根据细胞代谢情况1~2天换液一次;倒置显微镜下每日观察小胶质细胞形态。
4.小胶质细胞的鉴定小胶质细胞长成片后,取出盖玻片,依次用0.9%生理盐水清洗3次,每次5分钟;4%多聚甲醛固定40分钟;0.01M pH7.3的PBS清洗3次,每次5分钟,放入4e冰箱中保存备用。
SP法免疫:取长有细胞的盖玻片,0.25%T rition X-100(用0.01M PBS稀释),室温,5~10m in;5%羊血清(用0.01M PBS稀释),37e孵育30m in;CD11b(稀释度1:50)的单克隆抗体标记小胶质细胞,4e,孵育24h;生物素标记羊抗小鼠抗体1:100,37e,孵育2h;辣根酶标记链霉卵白素1:100,37e,孵育2h;DAB呈色,苏木素复染1分钟,盐酸分化,氨水返蓝,封片,镜下观察。
以PBS代替一抗做阴性对照。
5.细胞计数及CCK-8细胞活力分析分别于纯化后24h、48h、72h、96h在相差显微镜高倍镜(25@10)视野下随机选取10个视野计数小胶质细胞;将细胞种植于96孔板,种植浓度为2000ce lls/ w e l,l分时检测,每个时间点设8个复孔,另设8孔空白对照,空白对照为含10%胎牛血清的DME M/F12培养基。
分别于培养24h、48h、72h、96h后用进行胎盼蓝染色活细胞计数和CCK-8法检测细胞活力。
ELX-800酶标仪测定各孔OD值,测定波长450n m。
三、统计学分析应用SPSS11.0医学统计软件包进行数据统计处理。
随机抽取5张免疫细胞染色盖玻片进行小胶质细胞的纯度鉴定,每张片子分别计数3个高倍镜视野下的细胞数和阳性细胞数,计算阳性细胞数所占总细胞数比值,并用单样本t检验对阳性细胞率进行统计分析,P>0.05为差异无统计学意义。
不同时间点细胞数目及CCK-8OD值数据以x?s表示,进行方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。
结果1.小胶质细胞的鉴定及一般形态观察纯化分离的小胶质细胞进行CD11b抗体染色阳性细胞\95%(阳性细胞率为0.956?0.013,且P> 0.05,差异无统计学意义(图4)。
纯化分离的小胶质细胞多在30m i n~1h贴壁,形态上为圆形,边缘不规则。
培养第2天,可见小胶质细胞形态与第1天基本相同(图1);培养第3天,少数小胶质细胞出现单极突起(图2);培养第4天,绝大多数小胶质细胞出现双极突起并长成片(图3)。
2.细胞计数和CCK-8细胞活力分析经方差分析各时间点之间,小胶质细胞数目无显著性差异(P>0.05);CC K-8结果显示各时间点间细胞活力无明显改变(P>0.05,表)。
表不同时间细胞数及活力分析培养时间细胞数目(n=10)CCK-8OD值(n=8) 24h27.4?1.840.446?0.04048h27.9?1.450.426?0.04772h27.5?1.960.461?0.04696h28.2?2.100.459?0.038注:不同时间点细胞数目方差分析结果,F=0.253,P=0.859;不同时间点CCK-8OD值方差分析结果,F=0.413,P=0.745,差异均无统计学意义图1 纯化培养第2天 图2 纯化培养第3天图3 纯化培养第4天 图4 CD11b 免疫细胞鉴定讨 论小胶质细胞作为脑内的免疫效应细胞,是神经系统与免疫系统的交汇点,在脑内行使免疫监视和防御功能。