第３１卷第１期 ２０１３年２月 陕西科技大学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．３ｌ Ｎｏ．１
Ｆｅｂ．２０ｌ３
文章编号：１０００—５８１１（２０１３）０１—００８６—０４
窝儿七中化学成分活性的研究 杨秀芳 ，马养民 ，郑敬海 ，刘建军 ● （１．陕西科技大学化学与化工学院教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室 农林科技大学林学院，陕西杨凌 ７１２ｌＯＯ）
康永祥。
，陕西西安７１００２１；２．西北
摘 要：采用９６孔板微量稀释法对从窝儿七中分离纯化得到的化合物的抑菌活性进行研究， 测定获得了化合物对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苹果腐烂病菌、芍 药炭疽病菌、烟草赤星病菌、小麦赤霉病菌的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）．结果表明窝儿七中得到的 山奈酚、山奈酚糖苷、鬼臼毒素、鬼臼毒素糖苷、鬼臼毒酮、山荷叶素及山荷叶素糖苷对测试的 ８种菌均有一定的抑制作用．其中鬼臼毒素与鬼臼毒素糖苷对绿脓杆菌抑制作用最好，ＭＩＣ为 ６．２５／￣ｇ／ｍＬ．并对分离得到的化合物鬼臼毒素的镇痛作用进行研究，以阿司匹林为阳性对照， 生理盐水为阴性对照，通过热板法测定小鼠痛阈值，表明鬼臼毒素有一定的镇痛作用，与阿司 匹林相比其镇痛作用时间短，但镇痛作用见效快． 关键词：窝儿七；抑茵活性；最小抑茵浓度；镇痛作用 中图法分类号：Ｒ２８２．７ 文献标识码：Ａ
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｐｈｙｌｌｅｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌｉ． ＹＡＮＧ Ｘｉｕ—ｆａｎｇ ，ＭＡ Ｙａｎｇ—ｍｉｎ ，ＺＨＥＮＧ Ｊｉｎｇ—ｈａｌ ，ＬＩＵ Ｊｉａｎ—ｊｕｎ。， （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｕｘｉｌｉａｒｙ Ｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏ ｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００．Ｃｈｉｎａ）
ＫＡＮＧ Ｙｏｎｇ—ｘｉａｎｇ ｍｉｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｌｏｇｙ，Ｘｉ ａｎ ７１００２１，Ｃｈｉ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ Ｍｉｎｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｄｉｐｈｙｌ～ ｌｅｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌｉ．ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ９６一ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅ．ｃｏｌｉ， Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｖ．ｍａｌｉ，Ｃ．ＧＺ０ ０ ｏｒ ０ ｄ ｓ，Ａ．ａｌｔｅｒｎａｔｅ ａｎｄ Ｆ．ｇｒａ～ ｍ ｉｎｅａｒｕｍ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｏｄｏｐｈｙＩＩｏｔｏｘｉｎ， ｐｏｄｏｐｈｙＩＩｏｔｏｘｏｎｅ， ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ， ｄｉｐｈｙｌｌｉｎ，ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ一３一Ｏ—ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ，ｄｅｐｈｙｌｌｉｎ一１～Ｏ—ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ一１一（）一ｇｌｕ— ｃｏｓｉｄｅ ｈａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．ＰｏｄｏｐｈｙＩｌｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｐｏｄｏｐｈｙｌ— ｌｏｔｏｘｉｎ一１一Ｏ—ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｈａｄ ｎｏｔａｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｍｉｅｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＩＣ ６．２５／￣ｇ／ｍＬ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘ ｉｎ ｈａｄ ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉＶｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｓｈｏｒｔｅｒ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈａｎ ａｓｐｉｒｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄｉｐｈｙｌｌｅｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌｉ．；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ；ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎ— ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
收稿日期：２０１２－１１—３０ 基金项目：林业公益性行业科研专项项目（２００９４００４） 作者简介：杨秀芳（１９６３一），女，陕西铜川人，教授，研究方向：天然产物的提取与开发 第１期 杨秀芳等：窝儿七中化学成分活性的研究 ・ ８７ ・ ０ 引言 窝儿七是小檗科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）鬼臼亚科 （Ｐ０ ０ ＾ ｚｚ０ Ｐ口ｇ）山荷叶属（Ｄｉｐｈｙｌｌｅｉａ）的中华 山荷叶（Ｄｉｐｈｙｌｌｅｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌｉ．），是我国特有植 物，分布于陕西、甘肃、四川、湖北等地．其根茎和须 根可供药，根茎能消热、凉血、活血、止痛，并具有泻 下作用．主治腰腿疼痛、风湿性关节炎、骨蒸痨热、 跌打损伤、月经不调等症．须根能清热败毒、破血祛 瘀、凉血，多用于妇科病＿】］．窝儿七的化学成分以木 脂素类化合物为主，该类化合物主要应用于抗肿 瘤、治疣等＿２ ］．２００１年，谭苹等对４Ｏ种秦岭“七 药”最低抑菌浓度进行测试，将测试“七药”制成生 药原液，以不同的稀释度与１１种标准菌种共同培 养，观察其抑菌作用，以传统抗菌中药黄连作为对 照组．实验结果表明，窝儿七药液的抑菌作用明显 优于黄连 ］．为了进一步研究窝儿七化学成分的活 性作用，本文首次对从窝儿七分离纯化得到的化合 物的抑菌活性和镇痛活性进行了研究，期望从中获 得抑菌活性或镇痛作用好的化合物，为进一步开发 利用窝儿七提供理论依据．
１材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 样品 从窝儿七中分离纯化得到的山奈酚，山奈酚糖 苷，鬼臼毒素，鬼臼毒素糖苷，鬼臼毒酮，山荷叶素 及山荷叶素糖苷 ． １．１．２供试菌种 细菌４株：大肠杆菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、绿脓杆 菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、金黄色葡萄球菌 （Ｓ 口 Ｚ０ｃ０ｃｃ“ｓ ａｕｒｅｕｓ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）； 真菌４株：苹果腐烂病菌（Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ）、芍药 炭疽病菌（Ｃ．ｇＺ０Ｐ０ｓ 。 ｏ ｓ）、烟草赤星病菌 （Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、小麦赤霉病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）． １．１．３培养基 ＰＤＡ培养基：马铃薯（去皮）２００．０ ｇ，葡萄糖 ２０ ｇ，琼脂１８ ｇ，水１ ０００ ｍＬ． ＮＡ培养基：牛肉膏３．０ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａＣ１ ５ ｇ，琼脂２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．４～７．６．１２１℃ 灭菌２Ｏ ｒａｉｎ． １．１．４动物 雄性昆明种小鼠，１８～２２ ｇ，由第四军医大学
实验动物房提供（合格证号：ＳＣＸＫ（军）２００７—００７）． １＿２仪器 ＳＷ—ＣＪ一１ＦＤ超净工作台（上海博迅实业有限 公司医疗设备厂）、ＹＸ２８０Ｂ手提式压力蒸汽灭菌 锅（上海三申医疗器械有限公司）、１０１—１型干燥箱 （上海市实验仪器总厂）、ＤＨ５０００Ｂ电热恒温培养 箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、ＨＺＱ—Ｑ全温振 荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、ＭＫ３ 型酶标仪（Ｔｈｅｒｍｏ电（上海）仪器有限公司、 ＢＳ２２４Ｓ分析天平（格瑞恩科技发展有限公司）． １．３ 实验方法 １．３．１ 菌液制备 将在固体培养基上培养的大肠杆菌（Ｅ．ｃ）、绿 脓杆菌（Ｐ．０）、金黄色葡萄球菌（Ｓ．ａ）、枯草芽孢杆 菌（Ｂ．ｓ）、苹果腐烂病菌（ ． ）、芍药炭疽病菌（Ｃ． ｇ）、烟草赤星病菌（Ａ ａ）、小麦赤霉病菌（Ｆ．ｇ）从 恒温培养箱中取出，在灭菌后的超净工作台上将以 上各菌接种至配制好的液体培养基中，再将接菌后 的液体培养基转移至全温振荡器，温度恒定在 ２８℃培养４８ ｈ，备用． １．３．２试样制备方法 将从窝儿七中分离纯化得到的山奈酚、山奈酚 糖苷、鬼臼毒素、鬼臼毒素糖苷、鬼臼毒酮、山荷叶 素及山荷叶素糖苷，分别称取０．２ ｍｇ，用２ ｍＬ二 甲基亚砜溶解，备用． 鬼臼毒素水溶液：将窝儿七中分离得到的鬼臼 毒素样品用蒸馏水配制成５组鬼臼毒素水溶液，浓 度分别为１ ｍｇ／ｋｇ、３ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍｇ／ｋｇ、３０ ｍｇ／ ｋｇ、１００ ｍｇ／ｋｇ，每组１Ｏ ｍＬ，备用． １．３．３ 最小抑菌浓度（ＭＩＣ）的测定 （１）取紫外消毒的９６孔板，竖排依次编号Ａ、 Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ，横排依次编号１、２、３、４、５、６、 ７、８（编号为Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８， Ｂ１…Ｂ８…・Ｈ１一Ｈ８，Ｉ１一Ｉ８）．选取一种稀释过的菌 悬液，在灭菌后的超净工作台上，用移液枪吸取 １００ Ｌ菌悬液放置在板孔中，重复此操作，在编号 的孔板注入１００ Ｌ菌悬液． （２）在灭菌后的超净工作台上，取配制好的待 测鬼臼毒素样品，用移液枪吸取１００ Ｌ注入在已 有菌悬液的Ａｌ孔中、混匀．待菌悬液与鬼臼毒素 样品混匀后，再用移液枪从Ａ１孔中吸取混合液体 １００ Ｌ，注入Ａ２孔中，依次进行倍半稀释，将Ａ１一 Ａ８孔分别注入鬼臼毒素样品．最后，从Ａ８孔中吸 取出１００ Ｌ混合溶液，弃掉．经过此步操作Ａ１一Ａ８