前言胚胎干细胞(Embryonic stem cells ，ESCs ) 是胚胎源性多能干细胞．是从早期胚胎细胞团（inner cell mass，ICM)或着床后胚原始生殖细胞(Primor- dial germ ceils，PGCs )分离和克隆出来的一种具有无限增殖能力和全向分化能力的干细胞[1]。

这两类细胞均可分化为包括神经细胞、造血干细胞、心肌细胞等在的各种细胞[2]。

ESCs的发育全能性备受科学界的关注，而它所具有的广泛应用价值，已经成为当今国外生命科学研究的热点。

第一章 ESCs 研究中的相关知识1．1 胚胎干细胞1981年英国剑桥大学Evans和Kaufman首次对延迟着床的小鼠囊胚进行体外培养,首次分离得到小鼠ESCs。

此后，人们又相继用不同的方法从猪、牛、兔、羊、猴等哺乳动物分离得到 ESCs。

迟至1998年，美国威斯康辛大学的生物学家 James Thomson及其同事才首次分离、建成了第一个人的胚胎干细胞系[3]。

这一成果给移植治疗、药物发现及筛选等等带来深远的影响，打开了在体外培养更多类型的可供移植治疗的人体细胞、组织和器官的大门。

1．2 胚胎生殖细胞 (Embryonic germ cells，EGCs)EGCs是来自于早期胎儿生殖嵴的PGCs，是早期胚胎多能干细胞中的一种，具有自我更新和无限增殖的能力，能分化成代表三个胚层组织细胞能力的干细胞。

Matsui等(1992 )和Res- nick等(1992)体外长期培养小鼠PGCs，建立了小鼠PGCs系,发现在适宜条件下,其在形态上和发育上类似于 ESCs，称为EGCst[4]。

1998年，美国学者Shamb- lott等首先从受精后5—9周的人胚胎生殖嵴分离，培养并建立了EGCs系。

1．3 原始生殖细胞PGCs是生殖谱系区别于体细胞的最初形式，是哺乳动物生殖细胞的祖细胞，早在1980年以前，Jeon和Brinster就分别对小鼠的PGCs的形态结构和能量代进行了研究；1992年，Matsui 等和Resniek等以分离小鼠胎儿的PGCs为材料,培养传代获得ESCs.从而首次较为全面地证实PGCs同样可以作为ESCs分离克隆的原材料[5]。

第二章 ESCs的来源2.1 传统方法从发育良好的囊胚中分离细胞群细胞或从5-9周的胚胎生殖腺中分离胚胎干细胞。

培养条件：需要特殊的培养液、饲养细胞（人或胚鼠的成纤维细胞）、需要加入白雪病抑制因子抑制分化。

1981年美国科学家Evans和Kaufman从小鼠胚胎分离出胚胎干细胞病成功建立，从此开辟了哺乳动物胚胎干细胞研究的新纪元。

1990年Thomsn和Gearhrt利用细胞团和原始生殖细胞分别建立了人的胚胎干细胞系，这一结果的宣布将胚胎干细胞的研究又解开了新的一页！国在胚胎干细胞方面的综合性研究起步晚（1989年），但发展迅速。

在基础研究方面，尚克刚、赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系，盛慧珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。

在研究方面，著名胚胎工程专家窦忠英的科研小组已第6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动样细胞团。

中国军事医学科学院发现了“人胚胎干细胞素”，用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果！2.2 体细胞核移植通过显微操作和细胞融合技术，见单细胞核体（卵裂球或体细胞的核）一如去核的受体（卵母细胞或受精卵）胞质构成重组胚，通过对重组胚的激活、培养得到动物胚胎干细胞。

Willmut 等从一只六岁妊娠母羊乳腺中采取细胞，经培养传代和血清饥饿法处理后，通过核移植得到277枚融合胚，再经体培养后有29枚发育到囊胚，移植给13只受体母羊，其中有一只妊娠并最终产下了一只活羔，从而诞生了世界首例成年体细胞核移植后代。

自从利用分化的成年乳腺细胞的大第一只体细胞克隆绵羊多利，其它物种的克隆也取得了很大的进展。

体细胞克隆牛、山羊、鼠、猪和兔相继获得成功。

在目前的克隆实验中，不同物种间克隆的效率略有区别，但总效率不高！2.3 iPS细胞iPS细胞首先是由Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。

他们利用叛转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多能型有关的基因—Oct4、Sox2、c-myc、Kif4。

接着，利用里一个多能性标志分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选，最终得到了具有胚胎干细胞某些特征的多能性干细胞，并命名“诱导产生的多能性干细胞”。

一年后，3家实验室各自的研究证实了该结果的可靠性，并且提高了生产的iPS细胞的质量。

不久，另外两项研究相继报道了利用形态学作为筛选标准来建立iPS细胞的方法，这一方法在建立人类iPSxde 研究中具有潜在的优势。

在新近研究中，Yamanaka等人用他们在小鼠中使用过的4种银子实现了人类皮肤成纤维细胞的重编程；而Thomson实验室选用的是他们自己筛选出的4种银子Oct4,Sox2,Nanog和Lin28，其中Oct4和Sox2在Yamanaka的研究中也很关键。

紧随其后，Yamanaka小组又在原有工作基础上取得重要突破；从4个转录因子中去掉了肿瘤相关因子C-Myc，使iPS细胞的产生更为安全。

目前，已有研究将iPS细胞用于治疗镰刀型贫血症小鼠。

在短短一年多的时间里，iPS细胞的建立方法有了明显的改善，并且成功的应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的治疗，说明这一方法既有可操作性和稳定性，并且其安全性也在不断提高，因此这种方法对将来的医学研究有着巨大的价值！第三章 ESCs的基本特征3．1 形态学特性各种动物的ESCs具有与早期胚胎细胞相似的形态学结构：细胞体积小，胞质胞浆少，细胞核大，有一个或多个核仁，胞质结构简单，散布着大量的核糖体和线粒体，核形正常，保留了双倍体性质。

在体外培养的小鼠ESCs紧密堆积，呈集落状生长，细胞之间界限不清，集落边缘可见少量已分化的扁平上皮细胞或梭形成纤维细胞。

不同动物胚胎干细胞直径有所不同。

总的来说，ESCs具有与胚胎细胞相似的形态特征。

3．2 基本特征3．2．1 多能性(Pluripotency)ESCs的多能性是指ESCs具有分化出多种细胞组织的潜能，参与部分组织的形成。

表明ESCs 发育多能性的检测方法很多，主要有：①形成类胚体：体外培养诱导分化实验，将ESCs在不含分化抑制物的培养基上培养。

可形成胚样结构类胚体，类似于正常胚胎的囊胚期，随后可进行不同程度的分化产生多种分化细胞。

②特定组织：将ESCs在含有特定添加物的培养基中培养，可定向分化形成特定组织。

③嵌合体：通过显微注射或其它方式使ESCs与受体胚结合，嵌合后，嵌合体就会参与多种组织发育。

3．2．2可操作性ESCs的可操作性，是指ESCs可进行遗传操作选择(如导入异源基因、基因重组)等生物学特性。

在体外抑制分化培养时，ESCs不但可以增殖，而且可以被用来进行各种操作，而这一点是以ESCs的以下两方面特性为前提的：①在对ESCs进行各种操作的过程中，其仍能保持其扩增和发育的全能性和多能性。

②用于移植时，不易产生免疫排斥反应。

由于来源于着床前胚胎的 ESCs的某些细胞表面免疫相关蛋白(如MHC)还未来得及表达，用于移植时不易产生免疫排斥反应，因此使其成为移植治疗和细胞治疗的潜在资源[6]。

3．2．3全能性(totipotenty)ESCs的全能性是指其在解除分化抑制的条件下，能发育为构成机体不同细胞类型中包括生殖腺在的任何一种细胞的潜力。

ESCs具有很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织和器官。

细胞全能性的实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。

3．3 ESCs建系概况ESCs建系的原理是将早期胚胎或是用外科手术法得到的细胞团或者PGCs，与分化抑制物共同培养，使之增殖而又保持未分化状态，这样代代相传，从而使数量有限的胚胎或者 PGCs 能够成千上万倍的克隆。

第四章 PGCs用于胚胎干细胞培养4．1 意义ESCs因其发育的全能性和多样性而备受关注。

虽然来源于PGCs的ESCs与来源于ICM的细胞同属胚胎干细胞系，但相比之下，前者具有着更加巨大的科学意义和实践价值：①由于获得囊胚细胞团来源的ESCs需要破坏具有生命的胚胎，所以这项研究在许多国家是被禁止或严格限制的[7]，而PGC来源于早期流产的胚胎，于是来源于PGCs的EGCs系的建立给研究人员带来了新的希望；②PGcs 是胚胎形成后机体的干细胞，与胚泡期的细胞团相比，经历了着床的筛选，而生理状态下有相当量的胚泡因生长发育不良而不能正常着床并自行排出，因此PGCs 的健康程度应远远高于ICM[8]；③虽然PGCs用于ESCs的培养还存在诸多问题，但无论在数量上还是取材方法上，PGCs的获取均比桑椹胚和囊胚的获取容易,因而更具有实际的应用价值。

4.2 PGCs用于ESCs培养的影响因素4.2.1 基础培养基的选择ESCs的体外培养工作要求在严格的无菌条件下进行。

常规使用的培养液有白血病细胞抑制因子(LIF)、胎牛血清、L一谷氨酸、非必须氨基酸(NEAA)以及高浓度的DME等。

因DMEM比较适于生长速度快和呈集落状生长的细胞，而PGCs正符合这一特点。

因此采用DMEM为基础培养液是能够满足胚胎干细胞和饲养层细胞的生长要求的[9]。

4.2.2饲养层对胚胎干细胞的影响适宜饲养层的使用使得体外培养的PGCs增殖成为可能。

目前广泛应用的饲养层有三种，STO(一种已建系的小鼠胚胎成纤维细胞)、Pmef(小鼠原代胚胎成纤维细胞)。

由于后者所模拟的体外培养条件与PGCs在体生长的环境更为接近。

故更有利于ESCs生长[10]。

近年来，研究人员通过实验发现，以睾丸支持细胞(SCs)作为饲养层与PGCs共饲养，可明显提高PGCs的增殖能力[11]，SCs除可以产生大量CL外，还可产生层粘连蛋白(LN)(一种黏附蛋白)，另外，SCs还能分泌多种源性生长因子和分泌抑制因子，包括LIF、SCF(干细胞生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞因子)等。

因此，从理论上说，可提取动物睾丸SCs，然后将PGCs与SCs共培养，不仅可促进PGCs贴壁。

而且能有效地抑制体外培养中PGCs的分化，的确是一项值得继续研究与开发的好方法。

第五章 ESCs的应用前景ESCs的应用最主要的应用是基础科学研究、医学和农业科学等方面，特别是在发育生物学、克隆动物、药学研究以及组织器官的修复移植等方面有着无比广泛的应用前景[12]。

5．1 克隆动物的生产由于ESCs具有全能性和多能性，并可以在体外增殖、分化，因而是克隆动物的理想材料，ESCs的运用大大加快了家畜育种工作的进程，迅速提高有利于基因及其组合在群体中的比例。