广西医学　２０１３年１０月第３５卷第１０期　醛糖还原酶基因多态性及其活性与　广西汉族２型糖尿病微血管病变关系的研究▲　１２９１　

巫丽丽泶　沈昱　梁杏欢　罗佐杰秦映芬李励周　嘉冼　晶　（广西医科大学第一附属医院内分泌科，南宁市５３００２１，Ｅ－Ｍａｉｌ：ｗｕｌｉｌｉｇｘｍｕ＠１２６．ｃｏｒｎ）　【摘要】　目的探讨醛糖还原酶（ＡＲ）基因多态标记（ＡＣ）ｎ与广西汉族２型糖尿病微血管病变（ＤＭＡＰ）　的关系。方法用聚合酶链反应（ＰｅＲ）方法检测广西汉族５４例糖尿病微血管病变（ＤＭＡＰ组）、５６例糖尿病　无微血管病变（ＮＤＣ组），４９例健康对照组（ＣＯＮ组）的ＡＣ活性，比较各组间的等位基因频率和基因型频率。　结果ＡＲ活性在ＤＭＡＰ组最高，ＮＤＣ组次之，ＣＯＮ组最低（Ｐ＜０．０５）。ＤＭＡＰ组ｚ＋２等位基因频率显著低　于ＮＤＣ和ＣＯＮ组（Ｐ＜０．０５）。ＤＭＡＰ组携带ｚ＋２／Ｚ＋２等位基因的ＡＲ活性最低（Ｐ＜０．０５）。结论ＡＲ的　激活可能与广西汉族ＤＭＡＰ发病相关，ｚ＋２等位基因可能为ＤＭＡＰ的抑制因子，为其保护基因。　【关键词】２型糖尿病；糖尿病微血管病变；醛糖还原酶；基因多态性；广西；汉族　【中图分类号】Ｒ　５８７．１　【文献标识码】Ａ　【文章编号】０２５３．４３０４（２０１３）１０．１２９１．０４　ＤＯＩ：１０．１　１６７５／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３—４３０４．２０１３．１０．０６　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ａｌｄｏｓｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｔｙｐｅ　２　Ｄｉａｂｅｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ　ｏｆ　Ｈａｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇ￣ｄ　ＷＵ　Ｌｉ—ｌｉ，ＳＨＥＮ　Ｙｕ，ＨＡＮＧ　ｎ・ｈｕａｎ，ＬＵＯ　Ｚｕｏ－ｊｉｅ，ＱＩＮ　Ｙｉｎ－ｆｅｎ，１Ｉ　Ｌｉ，ＺＨＯＵ．１ｉａ，ＸＩＡＮ　Ｊｉｎ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｉｌ￣ｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３００２１，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｔ　５　ｅｎｄ　ｏｆ　ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　（ＡＲ）ｇｅｎｅ［（ＡＣ）ｎ］ａｎｄ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ（ＤＭＡＰ）ｏｆ　Ｈａｎ　ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇｘｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｏｌｙ－　ｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ（ＡＣ）ｎ　ａｍｏｎｇ　１５９　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈａｎ　ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇｘｉ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　５４　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ（ＤＭＡＰ　ｇｒｏｕｐ），５６　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｍｉｃｒｏａｎ－　ｇｉｏｐａｔｈｙ（ＮＤＣ　ｇｒｏｕｐ）ａｎｄ　４９　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（ＣＯＮ　ｇｒｏｕｐ）．Ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ．ＲｅｓＩｌｌｔｓ　ＡＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＤＭＡＰ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＮＤＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＣＯＮ　ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＣＯＮ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｚ＋２　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＤＭＡＰ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＮＤＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＣＯＮ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆＡＲ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ａｌ—　ｌｅｌｅ　ｏｆ　Ｚ＋２／Ｚ＋２　ｉｎ　ｔｈｅ　ＤＭＡＰ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＲ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ａｓｓｏ—　ｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ＤＭＡＰ　ａｍｏｎｇ　Ｈａｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｚ＋２　ａｌｌｅｌｅ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ａｎｄ　ｐｒｏ—　ｔｅｃｔｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＤＭＡＰ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ；Ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｅｔａｓｅ；Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；Ｇｕａｎｇｘｉ；　Ｈａｎ　ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｙ　糖尿病微血管病变（ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ，　ＤＭＡＰ）是糖尿病常见的慢性并发症，近年来有学者　提出糖代谢的多元醇代谢通路的激活是ＤＭＡＰ的重　要发病机制　。醛糖还原酶（ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＡＲ）是　该通路的重要限速酶，该酶基因表达异常或酶活性改　变将影响ＤＭＡＰ的发生。Ｈｅｅｓｏｍ等　研究发现１型　糖尿病具有ｚ＋２等位基因的患者发生糖尿病肾病的　危险性大大减少。邹效漫等　研究发现在２型糖尿　▲基金项目：广西自然科学基金（０３４２００９—１）　通信作者：梁杏欢，Ｅ—Ｍａｉｌ：ｌｘｈｅｎｎｎ＠１６３．ｃｏｒｎ；※现工作单位：

广西医科大学附属肿瘤医院　ｌ２９２　病患者中ＡＲ的激活对ＤＭＡＰ的发生发展起重要作　用。也有研究发现基因微卫星多态性及与２型糖尿　病视网膜病变有一定关联的Ｚ一２等位基因可能是　ＡＲ的激活因子，ｚ＋２等位基因则为抑制因子　ｊ。　目前国内外对ＡＲ基因５　端的（ＡＣ）ｎ重复序列多态　性及其活性的研究结果尚存在一定差异，且联合分析　ＡＲ基因５　端的（ＡＣ）ｎ多态性及其活性与ＤＭＡＰ关　系的报告不多见。本文旨在探讨ＡＲ标记（ＡＣ）ｎ与　广西汉族ＤＭＡＰ的关系。　１资料与方法　１．１　临床资料选择在我院住院或门诊就诊的２型　糖尿病患者１１０例，均为广西汉族人，彼此之间无血　缘关系。１１０例中无微血管病变（ＮＤＣ组）５６例，　男３２例，女２４例，年龄（５５．３０　４－１２．１７　岁，病程　（３．４４　４－１．６５）年，体重指数（２２．６８±３．５０）ｋｇ／Ｍ　；并　发微血管病变５４例（ＤＭＡＰ组）男２９例，女２５例，年　龄（５７．９３±９．６５）岁，病程（１０．１３±２．３３）年，体重指　数（２３．１６－４－４．０２）ｋｇ／Ｍ　。同期选择在我院体检的健　康者４９例为对照组（ＣＯＮ组），男２９例，女２Ｏ例，　年龄（５４．４１　４－９．２４）岁。糖尿病诊断标准为空腹血　糖＞７．０　ｍｍｏｌ／Ｌ，币Ⅱ／或服糖后２　ｈ血糖＞１１．１　ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ；　ＤＭＡＰ诊断标准为糖尿病患者微小动脉和微小静脉　之间出现微循环障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜　增厚　。３组的年龄、性别、体重指数比较差异无统　计学意义（Ｐ＞０．０５），具有可比性。　Ｉ．２　方法　（ＡＣ）ｎ基因多态性的检测采用聚合酶　链反应（ＰＣＲ）方法：抽取外周静脉血５　Ｉｌｌｌ，加入明胶　提取白细胞，白细胞弹性蛋白酶破碎白细胞，氯仿去　蛋白，异戊醇沉淀，提取ＤＮＡ。利用特异性引物，扩　增目的基因，ＡＲ上游引物１：５　一ＧＡＡＴＣｒＩ－ＩＩＡＡＣＡＴ—　ＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣ－－３　，ＡＲ下游引物２：５　一ＧＣ—　ｃｃＡＧｃｃｃ　ｒＡ　ｒＡｃｃＴＡ　；ＰＣＲ扩增：反应体系总　Ｇｕａｎｇｘｉ　ＭｅｄｉｃａＺ　ＪｏｕｒｎａＺ，Ｏｃｔ．２０１３，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．１０　体积２５　ｌ，含基因组ＤＮＡ２５０ｎｇ，引物各ｌＯｐｍｏｌ，　ＭｇＣ１２　２００　Ｉ．ｄ／Ｌ，ｄＮＴＰ　２　，Ｔａｑ酶０．２　ｔｄ。在ＰＣＲ　仪（ＭＪ　ＰＴＣ－２２０）上进行扩增。ＰＣＲ反应参数为：　９４℃预变性５　ｍｉｎ，９４ｏＣ变性１　ｍｉｎ，５６￣Ｃ退火３０　ｓ，　７２℃延伸１　ｍｉｎ，４０个循环。末次循环后于７２℃延伸　７　ｍｉｎ，４￣Ｃ保存。ＰＣＲ产物１０　与１５　上样缓冲　液混匀后，１００ｏＣ变性１０　ｒａｉｎ，选用ｐＵＣ１９　ＤＮＡ／ＭＳＰＬ　Ｍａｒｋｅｒ　２３及３条标准扩增产物在电泳中作为ＤＮＡ　标准参照物，与其他待测样品一同电泳，选取部分等　位基因纯合子的ＰＣＲ产物经ＡＢＩ　３１００遗传分析仪　测序。绘制醛糖还原酶荧光强度和浓度的标准曲线　并计算回归方程。　１．３统计学分析采用ＳＰＳＳ　１３．０软件进行数据处　理，计量资料以（　４－ｓ）表示，两组间均值比较采用ｔ　检验，多组问均数比较用方差分析，两两比较运用　ＳＮＫ－９分析；计算样本等位基因频率和基因型频率，　组间频率比较采用构成比的ｘ　检验，以Ｐ＜０．０５为　差异有统计学意义。　２结果　２．１　３组的ＡＲ比较ＡＲ活性ＤＭＡ组为（８９０．１２　４－　６５．３４）　ｇ，ＮＤＣ组为（８５８．１７　４－５８．３０）　ｇ，ＣＯＮ组　为（１８７．９０￣４７．７８）　ｇ，３组比较差异有统计学意义　（Ｆ＝４６．９７，Ｐ＝０．０００），其中ＤＭＡＰ组＞ＮＤＣ组＞　ＣＯＮ组。　２．２　７种等位基因分布频率比较ＰＣＲ产物的长度　为１３２～１４４ｂｐ，含（ＡＣ）ｎ的重复数为２１、２２、２３、２４、　２５、２６、２７，依次命名为Ｚ一６、Ｚ一４、Ｚ一２、Ｚ、Ｚ＋２、Ｚ＋　４、ｚ＋６。基因型分布符合Ｈａｒｄｙ—Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡。　ＤＭＡＰ组ｚ十２等位基因频率低于ＮＤＣ组和ＣＯＮ组　（Ｐ＜Ｏ．０５）；其余６种等位基因频率３组间比较差异　无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。见表１。　表１各组等位基因频率分布比较（频率，％）　

注：与ＤＭＡＰ组比较，△为Ｐ＜０．Ｏ５　２．３　各组不同等位基因型携带者ＡＲ活性比较３　

组各等位基因型携带者的ＡＲ活性比较，差异均有统　广西医学　２０１３年１０月第３５卷第１０期　计学意义（Ｐ＜０．０５），ＤＭＡＰ组与ＮＤＣ组各基因型的　ＡＲ活性比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；ＣＯＮ组　１２９３　的ｚ＋２／Ｚ＋２基因型携带者ＡＲ活性最低（Ｐ＜０．　０１），见表２。　表２各组不同等位基因型携带者ＡＲ活性比较（　±ｓ，ｒＣｇ）　

注：与ＣＯＮ相比，｝为Ｐ＜Ｏ．Ｏ１，同组内不同基因型与Ｚ＋２／Ｚ＋２相比，＃为Ｐ＜Ｏ．０１　３讨论　ＡＲ属于还原型辅酶Ⅱ（ＮＡＤＰＨ）依赖型醛糖还　原酶家族，存在于多种组织中。糖代谢的多元醇通路　由ＡＲ及山梨醇脱氢酶（ＳＤＨ）共同构成，其中ＡＲ是　重要的限速酶。研究表明醛糖还原酶基因的不同表　达程度影响糖尿病慢性并发症的发生　Ｊ。高血糖是　ＡＲ激活的重要因素。血糖长期控制不佳是引起糖尿　病并发症重要原因；同时高血糖状态下，ＡＲ活性增　高，引起多元醇通路的激活，后者通过启动葡萄糖及　脂质氧化应激、高渗应激、蛋白质的非酶糖基化作用　造成糖尿病微血管病变的发生发展　。　本研究发现广西汉族２型糖尿病患者中存在ＡＲ　基因５　端微卫星多态性，在ＡＲ存在７种等位基因　（即Ｚ一６～ｚ＋６）。ＣＯＮ组和ＮＤＣ组的各种等位基　因分布频率差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），而ＤＭＡＰ　组ｚ＋２等位基因频率显著低于ＮＤＣ组和ＣＯＮ组　（Ｐ＜０．０５），提示携带ｚ＋２等位基因者可能对ＤＭＡＰ　有一定的抵御性，ｚ＋２等位基因可能是ＤＭＡＰ的保　护因子。本文观察发现ＤＭＡＰ组的ｚ一２等位基因频　率未明显增高，这与刘丽梅等　的结论有所不同，可　能的原因是：（１）广西汉族２型糖尿病患者不存在这　个易感基因；（２）本文样本量过少，扩大样本量是否会　出现ｚ一２等位基因频率显著性增高有待深入探讨。　本文结果发现，携带ｚ一２等位基因组ＡＲ活性　最高（Ｐ＜０．０５），携ｚ＋２等位基因组ＡＲ活性最低　（Ｐ＜０．０５），提示ｚ一２等位基因可能通过某种机制　激活ＡＲ，而ｚ＋２等位基因对ＡＲ的激活有一定的抑　制性，这与Ｏｌｍｏｓ等　的研究结果相符。然而，对于　ｚ＋２／ｚ一２基因型，情况就显得较为复杂，由于两种　等位基因的作用相反，ＡＲ活性的高低取决于哪种等　位基因起主要作用。从本研究结果来看，其ＡＲ活性　居于携带ｚ＋２和ｚ一２等位基因者之间，说明两者可　能为共显性。但因本次研究样本量较少，此结果尚需　进一步验证，我们将在后续的研究中进一步探讨。　高血糖和ＡＲ基因５’端（ＡＣ）ｎ的多态性对ＡＲ　活性均有影响，为了解它们之间的相互作用，本研究　比较了ＣＯＮ组、ＤＭＡＰ组和ＮＤＣ组分别携带Ｚ一２和　ｚ＋２等位基因者的ＡＲ活性，结果显示：３组均携带　ｚ一２或ｚ＋２等位基因，但ＤＭＡＰ组和ＮＤＣ组的ＡＲ　活性均高于ＣＯＮ组（Ｐ＜０．０５）；ＤＭＡＰ组和ＮＤＣ组　携带ｚ一２等位基因组ＡＲ活性高于ＣＯＮ组（Ｐ＜０．０５），　但ＤＭＡＰ组和ＮＤＣ组之间无差别；ＣＯＮ组携带ｚ＋２　等位基因组ＡＲ活性最低；说明血糖和ＡＲ基因５　端　（ＡＣ）ｎ的多态性对ＡＲ活性的影响可能有协同作用，　高血糖能增强ｚ一２等位基因对ＡＲ的激活，而ｚ＋２　等位基因对ＡＲ激活的抑制作用在血糖正常情况下则　更为明显。高血糖和ＡＲ基因５　端（ＡＣ）ｎ的多态性　究竟通过何种途径和哪些具体环节激活ＡＲ从而影响　糖尿病微血管病变的发生还有待于继续深入的研究。　参考文献　［１］Ｄａｇｈｅｒ　Ｚ，Ｐａｒｋ　ＹＳ，Ａｓｎａｇｈｉ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ａｎｄ　ｈｕ－　ｍａｎ　ｒｅｔｉｎａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔ　ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｏｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００４，５３（９）：２　４０４—　２　４１１．　［２］Ｈｅｅｓｏｍ　ＡＥ，Ｈｉｂｂｅｒｄ　ＭＬ，Ｍｉｌｌｗａｒｄ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎ　５　一ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎ　ｔｙｐｅ　１　ｄｉａｂｅｔｅｓ　［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９７，４６（２）：２８７—２９１．　［３］邹效漫，陆菊明，潘长玉．醛糖还原酶基因５　端（ＡＣ）ｎ多　态性与２型糖尿病患者红细胞醛糖还原酶活性的影响　［Ｊ］．中华内分泌代谢杂志，２０００，１６（６）：３４６—３４９．　［４］　Ｓｉｖｅｎｉｕｓ　Ｋ，Ｎｉｓｋａｎｅｎ　Ｌ，ＶｏｕｔｉｌａＪｎｅｎ—Ｋａｕｎｉｓｔｏ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ａ１一　ｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ａｎｄ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｍｉ－　ｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔ