细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制

【摘要】目的 探讨细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）在高糖引起的β细胞胰岛素分泌障碍中的作用机制。方法 设立空白组、对照组（5.5mmol/L）和高糖组（33.3mmol/L）培养β-TC6细胞72h。采用丙酮酸脱氢酶（E1）活性检测试剂盒检测各组β-TC6细胞中E1活性。E1-siRNA转染细胞后，采用ELISA法检测各组核内乙酰辅酶A的变化情况；ChIP-qPCR法检测各组Islet1、Ins、Pdx1基因表达水平；Western blot法检测各组ISLET1、INS、PDX1蛋白表达水平。结果 与对照组相比，高糖组β-TC6细胞E1活性降低，间接表明PDC受损（P <0.05）；采用E1-siRNA处理后，核内乙酰辅酶A的生成量明显减少（P < 0.05）；细胞内的Islet1、Ins和Pdx1基因表达和蛋白水平均降低（P < 0.05）。结论 高糖会引起PDC损伤，造成核内乙酰辅酶A生成减少，胰岛素及其分泌相关基因和蛋白水平降低，导致胰岛素分泌障碍。

【关键词】丙酮酸脱氢酶复合体；高糖；乙酰辅酶A；乙酰化；胰岛素分泌障碍

Mechanism of pyruvate dehydrogenase complex in

nucleus in insulin secretion disorder caused by high

glucose

【Abstract】Objective: To investigate effect of pyruvate dehydrogenase

complex (PDC) in the nucleus on insulin secretion deficiency of β-TC6

cells induced by high glucose condition. Methods: β-TC6 cell was

cultured with blank group, control group (5.5mmol/L) and high glucose group (33.3mmol/L) for 72 hours. Pyruvate dehydrogenase (E1) activity

was analyzed by its kit. Acetyl-CoA in the nucleus of β-TC6 cell

transfected with E1-siRNA was measured by ELISA kit. The expressions

of Islet1, Ins and Pdx1 gene were detected by ChIP-qPCR. Their levels of

proteins were analyzed by Western blot. Results: E1 of β-TC6 cell

reduced under high glucose load (P <0.05). The amount of acetyl-CoA

decreased after β-TC6 cell was transfected with EI-siRNA (P < 0.05). The

gene expression and their protein levels of Islet, Ins and Pdx1 were

significantly inhibited (P < 0.05).Conclusion: High glucose condition

will cause damaging of PDC, decreasing production of acetyl-CoA,

suppressing expression of Islet, Ins and Pdx1 gene and their proteins,

which lead to insulin secretion deficiency.

【Key words】Pyruvate dehydrogenase complex; Acetyl-CoA; High

glucose; Insulin secretion disorder

丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex, PDC）是一种催化丙酮酸脱羧反应的多酶复合物，由丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）、二氢硫辛酸脱氢酶（E3）和六种辅助因子组成[1] 。其活性的调控主要通过E1的磷酸化和去磷酸化来实现[2]。

过去认为PDC在哺乳动物体内仅存在于线粒体中，作为线粒体基质内的重要的多酶复合物，利用饮食中的碳水化合物生成乙酰辅酶A产生能量[3]。但有研究发现PDC同样参与了细胞核内乙酰辅酶A 的生成，而在细胞核中，PDC参与生成乙酰辅酶A是为了实现组蛋白乙酰化[4, 5]。Chakrabarti[6]等研究阐述了组蛋白乙酰化在调控胰岛素基因的表达中的重要作用，并发现胰岛β细胞胰岛素基因启动子邻近区域的组蛋白H3乙酰化水平明显升，与糖尿病的发生关系密切[7]。同时Bajotto[8]和Wu[9] 等发现2型糖尿病的发生发展伴随着PDC活性下降，并与胰岛素抵抗呈平行性改变[9]。由此我们猜测PDC可能参与了胰岛β细胞核中乙酰辅酶A的生成及其组蛋白的乙酰化，进而影响胰岛素分泌及其相关基因和蛋白的表达。目前还没有相关研究能够证明高糖引起的胰岛素分泌障碍[11, 12]与上述过程有关。因此，本研究以PDC为切入点，探讨核内的PDC在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制，为二型糖尿病的预防与治疗找到新的视角。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

小鼠β-TC6胰岛β细胞系（购买于中国科学院上海细胞库）；DMEM高糖培养基、PBS（以色列Biological Industries公司）、FBS和胰蛋白酶（Gibco公司）；Lipofectamine2000转染剂（Invitrogen公司）；RT-PCR试剂盒、引物（上海生工）；E1活性检测试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）；ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）；CHIP

Assay Kit（Millipore 17-245RF）；快速DNA产物纯化试剂盒和UltraSYBR Mixture（Low ROX）（康为世纪）；Anti-Histone H3 (acetyl

K27)、ISLET1、INS、PDX-1抗体（英国Abcam公司）；HRP标记的山羊抗兔抗体ΙgG二抗（美国Proteintech公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF，德国Merck公司）、RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱）。二氧化碳培养箱（HF90上海力申科学仪器有限公司），实时荧光定量PCR仪（CFX96）、小型垂直电泳槽、小型蛋白转运槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司产品）；细胞破碎仪（VCX800）（SONICS公司产品）；倒置显微镜（德国徕卡）。

1.2 方法

1.2.1 β-TC6细胞培养与干预

β-TC6细胞培养于含有15%FBS的高糖DMEM培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，当细胞汇合率达80%左右时，用0.05%胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。将处于对数生长期的β-TC6细胞同等密度分别接种于60nm培养皿中，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，弃上清。设定空白组（培养基不额外添加葡萄糖），对照组（添加5.5mmol/L葡萄糖），高糖组（添加33.3mmol/L葡萄糖）培养72h。收集细胞，采用E1活性检测试剂盒检测E1活性。根据样品的蛋白浓度Cpr，按照公式E1活性=1904*△A/Cpr计算各实验组的E1活性。

1.2.2 β-TC6细胞的转染

将处于对数生长期的β-TC6细胞接种于六孔板，采用新鲜不含抗生素的培养基培养（800μL/孔），待细胞长至90%融合时，预备转染。

将200μL无血清DMEM 高糖培养基和5μL 20μmol/L siRNA（siRNA序列见表1），800μL无血清DMEM 高糖培养基和20μL

1mg/mL的lip2000转染试剂分别混合。室温静置5min，将两种混合液等体积混合，静置20min。将上述混合好的siRNA-lip2000复合物加入到六孔板对应培养孔中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养5h，去除含siRNA培养基，更换完全新鲜的培养基，继续培养48h。

表1 各基因位点siRNA序列

名称 siRNA序列

E1-siRNA序列 Sense GGUCAGAUCUUUGAAGCUUTT

Antisense AAGCUUCAAAGAUCUGACCTT

Scrambled siRNA Sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

Antisense

ACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.2.3细胞核内乙酰辅酶A的检测

将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理的β-TC6细胞，采用无葡萄糖培养基培养24h后，分离提取细胞核。加入丙酮酸（10mmol/L）培养8h后，ELISA试剂盒检测细胞核内乙酰辅酶A的水平。

1.2.4染色质免疫共沉淀实时荧光定量核酸扩增技术（ChIP-qPCR）检测Islet1、Ins、Pdx1的基因表达

将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理后的β-TC6细胞，利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术特应性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并采用DNA产物纯化试剂盒对其进行纯化，得到纯化DNA产物。用q-PCR法检测纯化产物Islet1、Ins、Pdx1基因表达（引物序列见表2）。

表2 引物序列表

名称 序列

Islet1 Sense TTACCTTTTCGTTTGACCTTTGC

Antisense ACCCTGTTACTCCCCAATCTGAG

Ins Sense TCAGGCCATCTGGTCCCTTA

Antisense CCTGGACTTTGCTGTTTGGC

Pdx1 Sense AAACAAGTGCAGGTGTTCGC

Antisense CCCCAGATCGCTTTGACAGT

1.2.5 Western Blot法检测各组ISLET1、INS和PDX1蛋白的水平

将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理后的β-TC6细胞加入80μL含PMSF的 RIPA裂解液，裂解细胞提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。Western Blot法测定各组ISLET1、INS和PDX1蛋白的表达水平。

2 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计处理，正态分布的计量资料采用均数± 标准差（X±S）表示，各组数据采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t 法。 p<0.05时差异有统计学意义。

3 结果

3.1高糖培养对胰岛β细胞PDC活性的影响

方差分析显示空白组、对照组和高糖组中E1活性差异有统计学意义（F=27.775，P<0.05）。与对空白组相比，高糖组的E1活性下降（P<0.05）；与对照组相比，高糖组E1活性明显降低（P<0.05）（表3）。由此表明，高糖刺激能够抑制E1的活性，进而引起胰岛β细胞内PDC损伤。

表3高糖培养对PDC活性的影响

分组 样品例数 X±S  (μg/mL)

空白组 4 13.9028±2.0445

对照组 4 21.6227±2.1827

高糖组 4 10.2096±2.3894 *#

*与空白组比较 p<0.05；#与对照组比较 p<0.05

3.2 PDC受损对乙酰辅酶A生成量的影响

采用siRNA技术沉默E1后，方差分析显示空白组、Scrambled