依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体： ●电荷式分选
逻辑电路
稳定液流
测量区
液滴形成
液滴充电
液滴偏转
Hale Waihona Puke 分选收集电荷式分选
通道式分选
逻辑电路
稳定液流
测量区
捕获管
分选收集
第二部分
流式细胞术在临床医学中的应用
流式临床应用
淋巴细胞亚群分析 血小板活化 HLA-B27 PNH Th1/Th2 肿瘤学 移植免疫 细胞凋亡 四聚体
Tetramer法
直接法 敏感性高 不受TCR基因型的限制
用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5% 的CD8+细胞对CMV和EBV特异
Tetramer法
了解病毒特异性CTL和记忆性CTL 方面的一项革命
检测病毒特异性CD8细胞的金标准 (Gold Standard)
Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cells[J]. Science,1998,280:227
HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽
抗原特异性CTL的分析方法
51Cr释放实验
间接法
有限稀释法(LDA)
需大量的特异性CTLs作为效应细胞 需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力
酶联免疫斑点法(ELISPOT) 难以广泛应用
PCR法
扩增特异T淋巴细胞受体
敏感性高 但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测
上机
激光激发
细胞单列通过 测量区
1.散射光信号 2.荧光信号
分离、收集、 分析、光信号
细胞理化特 性分析图
流式细胞仪的构造及原理
FCM测量光信号获取与分析
散射光信号 ●前向散射光(FSC)----细胞大小 ●侧向散射光（SSC)---细胞粒度 （膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量） FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。 SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。
分子量 668 394 1069 1183 624 615 350 1270 370
PY
303
结合方式 碱基特异性
嵌入
无
嵌入
无
非嵌入
G-C
非嵌入
GC
非嵌入
AT
非嵌入
AT
非嵌入
AT
嵌入
GC
嵌入 (双链） 无
静电（单链）
嵌入 (双链） GC>AT
静电（单链）
激发锋（nm) 发射锋(nm)
493
630
482
根根据据FSFCS-CS-SSCS二C二维维点点图图，，可可以以容容易易的区区分分L出ymL(yRm3()RG3r)an.(GRr1a)n与(RM1o)n与o(MRo2n)o(R2)
Incident Light Source
Right Angle Light Dectector a Cell Complexity
常
用
淋
R
巴
细
胞
亚
群
报 告 模 式
深圳 市人 民医 院流 式细 胞术 报告 单模 式
HLA-B27
通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其 B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光 强度则为阴性，反之为阳性。
Th1/Th2细胞
616
320,445
575
320,445
575
343
480
343
455
540
650
540
655
492
530
640
549-562
565-574
细胞周期分析
G1
S
Go G2 M
通过荧光探针对细胞周期进行相对DNA含量的测定，可分析细 胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNA异倍体
分选系统（Sorting)
Forward Light Detector a Cell Surface Area
R1
R1
R2
R2
R3
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
流式细胞术常用染料及检测波长
荧光染料的发射不同波长
DNA 和RNA荧光探针的理化特性
荧光探针 P1 EB MI CA3 HO33258 HO33342 DAPI 7-AAD AO
自身免疫性疾病
Diabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligo
移植
EBV and CMV
Tetramer-应用-例证
感染性疾病
➢含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病 毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关
肿瘤学
细胞凋亡
移植免疫
四聚体
Tetramer-原理
内源性抗原
外源性抗原
Tetramer-原理 MHC Class I-HLA-A2
Tetramer-原理
Tetramer-原理
国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105
Tetramer-应用
感染性疾病
HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSV
肿瘤
Breast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and Leukemia
➢慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者
肿瘤
➢用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞—用Tetramer分离，富集
移植
➢GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags) 的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败--HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床 治疗效果
➢HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力
第三部分 定量流式细胞术
定量流式细胞术的概述
定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝 对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。
流式细胞术的临床应用
第一部分
流式细胞仪（FCM)）工作原理
FCM系统结构
流体系统：样本流、鞘液 光学系统：激光光源、分光镜、滤片、
散射光和荧光探测器 分选系统：压电晶体、液流成滴、加电
系统、偏转系统 数据处理系统：计算机工作站
FCM工作原理流程：
加入荧光染料
样本（血液实 体组织）
单细胞悬液
荧光染料特异 染色的样本