2、增菌
（1）定性检测
将制备好的 1:10 样品匀液于 36 ℃±1℃培养 8 h～18 h。
（2）定量检测
•用无菌吸管吸取 1:10 样品匀液 1 mL，注入含有 9 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备 1:100 的样品匀液。
•另取 1 mL 无菌吸管，按之前操作程序，依次制备 10 倍系 列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支 1 mL 无菌吸 管。
MR:阳性 （红色）
左侧为阴性 对照
VP：阴性
五、抗原的特征
O抗原是耐热的菌体抗原，目前有O1~O13共 13种，可用于血清学鉴定。 K抗原是一种荚膜抗原，现有K1~K71，也用于 血清学鉴定。 中国大陆副溶血弧菌大部分是O3：K6。
六、检验实验
目前副溶血性弧菌的检验采用国标法（GB/T 4789.7—2013 ）
-
生 化
乳糖 硫化氢 赖氨酸脱羧酶
性
VP
+ -
状
ONPG
-
阳性：+ 阴性：-
3 ％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变 黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色 加深。
嗜盐性试验
挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种 0%、 6%、8%和 10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培养 24 h，观察液体混浊情况。
b.典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形、半透明、 表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香 糖的质感，直径 2 mm～3 mm。从培养箱取出 TCBS 平板后，应尽快（不超过 1 h）挑取菌落或标记要 挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养 基上的特征按照产品说明进行判定。
4.纯培养
在SS平板上，菌落中等大小，长出1～2mm扁 平、无色、半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈 粘稠状。
典型的副溶血性弧菌在TCBS琼脂培养基呈圆形、 半透明、表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触， 有类似口香糖的质感，直径2mm--3 mm 。
注：TCBS中文名：硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂培养基。
3﹪氯化钠三糖铁琼脂
挑取纯培养的单个可疑菌落，转种 3%氯化钠三糖铁琼 脂斜面并穿刺底层，36 ℃±1 ℃培养 24 h观察结果。副 溶血性弧菌在 3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄 不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深。
嗜盐性实验
6.确定鉴定
取纯培养物分别接种含 3%氯化钠的甘露醇试 验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP 培 养基，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h 后观察结
注：显色培养基成分：特殊营养物质（75.0 g/L）、混合显色剂（2.3g/L）、琼 脂（15.0g/L）。显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底 物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基。
四、生化特性
能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉和阿 拉伯胶糖，产酸，不产气。不发酵乳糖、蔗 糖、纤维二糖等。
•根据对检样污染情况的估计，选择 3 个适宜的连续稀释度， 每个稀释度接种 3 支含 9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管， 每管接种 1 mL。置 36℃±1℃恒温箱内，培养 8 h～18 h。
3.分离
a.对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面 以下 1 cm 内沾取一环增菌液，于 TCBS 平板或弧 菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块 平板。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。
副 溶 血 性 弧 菌 检 验 程 序
1.样品制备 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2-
5℃不超过18小时解冻。非冷冻而易腐蚀的样品 应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置710℃冰箱保存，在24h内检验。
鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃.贝 类取全部内容物,包括贝肉和体液,甲壳类取整 个动物，或者动物的中心部分,包括肠和鳃。
VP试验方法
VP试验方法 ： 取一种细菌的24h纯培养 物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置 37'C培养48～72h取出后在培养液中先加 VP试剂甲液0.6mL，再加乙液0.2mL，充 分混匀。静置在试管架上，15min后培养 液呈红色者为阳性，以“ ”表示；不变色
为阴性，以“—”表示。1h后可出现假阳 性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养 液中混合，静置，强阳性者约5min后就可 产生粉红色反应。
副溶血弧性菌常导致肠胃不适，伴随食物中毒 等症状。表现为急性肠胃炎，腹痛、吐泻、发 烧等特征。少数重症者引起原发性败血症。
副溶血性弧菌的发现
于1950年10月从日本大阪市，发生的一起咸 沙丁鱼食物中毒，患者肠道排泄物和食物中首 次分离出副溶血性弧菌。
在日本，副溶血性弧菌食物中毒约占细菌性食 物中毒的70%～80%.1958年上海市防疫站也从 烤鸭所致食物中毒的患者中分离出此菌。以后 在我国、日本、印度、美国等许多国家均陆续 报道有本病的发生。
以无菌操作取检样25g（或ml），加人3％氯 化钠碱性蛋白栋水225ml，用旋转刀片式均质器 以8000r/min取均质1min，或拍击式均质器拍击 2min，制备成1：10的均匀稀释液。如无均质器， 则将样品放人无菌乳钵中磨碎，然后放500mL的 灭菌容器内,加225ml 3%氯化钠碱性蛋白胨水， 并充分振荡。
果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行 ONPG
试验。
可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴 定系统。
ONPG试验
β -半乳糖苷酶试验（ONPG试验）简介

（1）β -半乳糖苷酶试验原理：有的细菌可产生β -半乳糖苷
酶，能分解邻-硝基酚-β -D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻
-硝基酚，在很低浓度下也可检出。
副溶血性弧菌
Vibrio parahaemolyticus
目录
一、引起疾病症状（致病性、流行病学情况） 二、基本情况及特征 三、培养特性 四、生化特性 五、抗原特征 六、检验方法（举例阐述检验某一食品、商品中该菌的 详细操作过程）
一.副溶血性弧菌疾病症状
副溶血性弧菌（Bibrio Parahemolyticus）， 进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐 菌食物中毒。
1966年国际弧菌命名委员会正式命名为副溶血 性弧菌。
中毒食品主要是海产品鱼、虾、蟹、贝类和海 藻等海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋
类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原 因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染．
副溶血性弧菌致病性
致病因子： 1、耐热直接溶血素TDH，肠毒素
2、耐热相关溶血素TRH，与TDH 相似。
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃； b) 冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃； c) 恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃； d) 均质器或无菌乳钵； e) 天平：感量 0.1 g； f) 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm； g) 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或 微量移液器及吸头； h) 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL、1000 mL； i) 无菌培养皿：直径 90 mm； j) 全自动微生物生化鉴定系统； k) 无菌手术剪、镊子。
副溶血性弧菌的流行病学
1、传染源 传染源为病人，集体发病时往往仅少 数病情严重者住院，而多数未住院者可能成为传染 源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌 迅速减少，故不至因病人散布病菌而造成广泛流行。
2、传播途径 本病经食物传播，主要的食物是海 产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼 等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。进食肉类或蔬菜而 致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。
1、需氧菌，需氧性很强，营养要求不高。 2、在含盐3～3.5%培养基中生长最好，无盐
条件下不能生长。 3、最适温度30~37℃，PH7.4~8.0。 4、不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂
抵抗力弱。
在液体培养基中，呈现浑浊，表面形 成菌膜，R型菌发生沉淀。
在固体培养基上的菌落通常为隆起， 圆形，稍混浊，不透明，表面光滑湿润， 传代之后出现不圆整、粗糙型菌落，或灰 白色半透明或不透明的菌落。
培养基和试剂
3％氯化钠碱性蛋白胨水 、硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆 盐-蔗糖（TCBS）琼脂、3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼 脂 、3％氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性试验培养基、3 ％氯化钠甘露醇试验培养基、3％氯化钠赖氨酸脱羧 酶试验培养基、3％氯化钠 MR-VP 培养基、3％氯 化钠溶液 、我妻氏血琼脂、 氧化酶试剂、 革兰氏 染色液 、ONPG 试剂、Voges-Proskauer（V-P） 试剂、 弧菌显色培养基、生化鉴定试剂盒。
从患者样品中分离的致病菌株在人或家兔红 细胞的培养基中生长，能产生β溶血。
海水中及海产品中分离的菌株不溶血，这个 现象称为“神奈川现象”。能在神奈川培养 基上产生β溶血者，称为神奈川实验阳性。
副 溶
Hale Waihona Puke 试验项目 革兰氏染色镜检氧化酶
血
动力
性
蔗糖
弧
葡萄糖
结果 阴性，无芽孢
+ + +
菌
甘露醇
+
的
分解葡萄糖产气

（2）试剂：0.75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在
加入缓冲液（6.9g NaH2P04溶于45ml蒸馏水中，用30% NaOH调整
pH为7.0，再加水至50ml）5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液为无
色，如出现黄色，则不应再用。

（3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成
触海产品的手应洗净擦干再接触其他食品。
二、基本情况及特征