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实验13地衣酚法测定rna含量-华南师范大学生命科学学院新

一、目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法(地衣酚法)的原理和操作技术。

二、原理
核糖核酸与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糖醛,后者与3,5—二羟基甲苯(地衣酚)反应呈鲜绿色,该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂,反应产物在670nm处有最大吸收,RNA浓度在20~200微克/毫升范围内,光密度与RNA的浓度成正比关系,在反应液中如混有DNA或其他杂质。

也能给出类似的颜色。

因此测定RNA时可先测定DNA的含量,再计算RNA的含量。

地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核糖,不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同,因此,用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。

最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线,然后从曲线求得被测样品的RNA含量。

三、材料、试剂和器具
(一)试剂
1、RNA标准溶液:取酵母RNA配成200微克/毫升的标准溶液(如不溶,可滴加氢氧化铵溶液,调至pH=)
2、样品溶液:RNA浓度在20~100微克/毫升范围内。

(自己提取)
3、地衣酚试剂,先配制%三氯化铁浓盐酸溶液(A、R)。

使用前再用上述溶液为溶剂配成%的地衣酚溶液。

(临用时配制)
(二)器具
1、试管及管架
2、水浴锅
3、移液管(1,2,5ml)
4、可见光分光光度计
四、操作步骤
(一)RNA标准曲线的制作
取8支试管,编号,按下表加入试剂
加毕,摇匀,置沸水浴中加热15分钟,冷却,测值。

以值为纵坐标,RNA含量(微克/毫升)为横坐标作图绘制标准曲线。

(二)样品的测定
取~毫升样品液于试管中,加蒸馏水稀释至2毫升,后加2毫升地衣酚试剂摇匀,于沸水中煮15分钟,冷却,测。

根据测得的光密度值,从标准曲线上查出相当该光密度的RNA 的含量,按下式计算样品中RNA的百分含量。

RNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数
RNA产率(%)=含量/毫升×总体积
×100新鲜肝重(g)×106
五、注意事项
样品中蛋白质含量较高时,应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。

六、实验报告
附上绘制标准曲线图,并计算RNA的含量及产率。

七、思考题
1、采用该法测定RNA的含量有何优点及缺点?
2、地衣酚反应中,干扰RNA测定的因素有哪些?如何能减少它们的影响?。

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