动物免疫学学院：动物科技学院班级：12级兽医硕士学号: 2012408012姓名：高家登细胞因子（干扰素）的研究进展细胞因子是由活化的淋巴细胞、单核巨噬细胞及一些基质、内皮细胞和成纤维细胞产生的一类非抗体、非补体的可溶性物质。

1957年Tsaacs等发现病毒诱导细胞产生一种能干扰病毒复制的可溶性蛋白质，将其命名为干扰素，这是正式命名的第一个(类)细胞因子。

此后，人们陆续发现了一系列的细胞因子。

20世纪70~80年代是细胞因子研究十分活跃的时期，在此阶段，有关细胞因子的研究有两个重要发展：一是细胞因子命名的统一；二是细胞因子纯化、鉴定技术的发展和基因重组技术的应用。

细胞因子具有广泛而重要的功能，但正常情况下机体内产量极微，因此，通过分子生物学手段获得重组细胞因子是临床应用及进一步阐明细胞因子功能的重要一步。

到目前为止，至少有7种动物的多种细胞因子被克隆，这些细胞因子包括了IL-1~IL-13、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等，在已克隆的细胞因子中，大多数已获得表达，其中以绵羊的表达种类最多，包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-A、INF-C等。

牛、鸡、猪、猫等的IL-2也已获得重组蛋白。

细胞因子的分类细胞因子种类很多，根据细胞因子的基本理化性状和主要生物学活性进行综合分类，主要细胞因子有：（1）白细胞介素(IL) 为在白细胞之间传递免疫调节信息的生物分子，目前已认定了至少15种IL(IL-1~15)，成为免疫学中最庞大、也是最重要的一类细胞因子。

（2）干扰素(IFN) 为能干扰病毒在宿主细胞内复制的一类蛋白质。

现已知IFN 可分成不同的类型，有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。

（3）造血生长因子(HGF) 能使造血前体细胞分化增殖的生物分子；主要作用是调节机体的造血功能，包括各种集落刺激因子和红细胞生成素等。

（4）肿瘤坏死因子(TNF) 能使肿瘤组织坏死并能杀伤肿瘤培养细胞的一类细胞因子，其中由巨噬细胞产生的称为TNF-α、由淋巴细胞产生的称为TNF-β。

下面具体介绍一下干扰素在畜牧兽医中的研究进展及临床应用：1、动物干扰素的分类动物干扰素的分类鉴定工作主要在哺乳动物中展开，目前按国际标准已经得到三大类干扰素，每一类干扰素有不同型，每一型又可被分成不同的亚型，其中I类干扰素(IFN-I)包括IFN-α、IFN- β、IFN- ω、IFN- τ、IFN-δ、IFN- κ、人IFN-δ 、IFN-τ，其中IFN -τ发现于反刍动物滋养层口，IFN-δ发现于猪孕体的滋养外胚叶；II类干扰素(IFN-II)中只包括IFN- γ，它的主要作用是激活巨噬细胞的杀灭微生物的作用；III类干扰素(IFN-III)指IFN- λ ，分IFN- λ-l，2和3三个亚型，也称为IL-28A，IL-28B和IL-29，与IFN-I相似，IFN-III 主要在对病毒的自然免疫中在为数不多的几种细胞中起作用。

2、动物干扰素的差异性动物干扰素在分类上虽然大体上分为三大类，但是与人干扰素不同，动物种类多，而在不同动物中得到的干扰素其在基因序列上有较大差异，例如：（国内夏春、汪明等）研究发现犬IFN-α与猪、猫和鸡干扰素同源性均低于30％，提示我们，对于动物干扰素的研究工作需要具体到种属上，同时也提示我们，动物在不同条件下经过长期的进化，形成了每种动物独特的生理特性，这是导致动物干扰素种间差异较大的一个原因，而随着多种动物类似的饲养管理模式和动物的继续进化，动物干扰素在结构和功能上可能也会有所改变，抓住这种进化规律，打破动物干扰素种间差异也将成为可能。

3、动物千扰素的作用机制干扰素在动物机体内的表达受基因的调控，动物细胞由于病毒或非病毒性诱生剂作用后，便可解除干扰素基因抑制物的作用，使基因得以表达，合成干扰素。

合成的干扰素再与特异的细胞受体结合，通过细胞因子的信号传递从而使细胞相应基因激活，产生的作用主要表现在三个方面：(1)抗病毒作用，主要是通过间接作用诱发多种蛋白因子ADAR、PKR、MX、OAS、RNaseL等发挥抑制病毒翻译、降解病毒RNA、抑制病毒复制和病毒外壳形成来实现抗病毒作用；(2) 抗细胞增殖作用，可调节增加MHC的表达，激活NK细胞和T细胞，抑制肿瘤细胞血管的生成，从而起到抗肿瘤细胞分化增殖的作用；(3)免疫调节作用，可增强免疫球蛋白IgG的受体表达激活并加强巨噬细胞的吞噬作用，及T细胞、B 细胞的激活作用，也可增殖NK细胞，提高动物机体的天然免疫系统的免疫作用。

4、动物干扰素的基因工程研究基因工程改造和生产干扰素是现在研究的一个重点，由于动物干扰素直接生产成本高、种间差异大和干扰素在动物体内不能长期稳定存在等原因，需要对其进行基因工程生产和改造，另外，干扰素动物分泌量低，所以研究利用基因工程方法，大批量制备高效高纯的干扰素也是研究方向之一。

现在国际上大部分采用酵母等真核生物细胞作为干扰素的表达系统，从理论上说更加接近于实际临床动物中的应用，国内目前还主要采用大肠杆菌、乳酸菌等原核生物细胞作为干扰素的表达系统和生物发酵器。

5、动物干扰素的临床应用现在动物干扰素在兽医临床上的应用还处于初级阶段，只用于一些常见的难以治愈的病毒性传染病，一般用于紧急应急，当接种某一疫苗后而免疫效力还未产生的一段时间内，辅助接种干扰素会起到紧急防治病毒性传染病的效果。

在临床应用性研究方面，国内外主要致力于提高干扰素效率、延长干扰素机体内半衰期和扩大动物干扰素的效力范围。

现在应用最多的是猪干扰素制剂，可是有研究表明猪干扰素制剂在对禽类、犬类疾病时效果并不理想，尤其是对犬类疾病时完全无效，而对于犬干扰素，由于专利的申请，限制了犬干扰素医药制剂的研发，而随着犬类动物在人类生活中越来越重要的作用，加速研发犬干扰素医药制剂，更好的防治犬类疾病已经成为研究的重点方向之一，可见动物种间差异对干扰素应用方面带来的影响较大。

为了提高干扰素效率、延长半衰期，很多学者尝试通过不同的方法进行研究，除基因工程改造外，还有学者通过设计新的干扰素载体来进行干扰素体内保护，使其作用效力更加稳定持久，其中日本学者研发的长效淋巴细胞样干扰素皮下应用剂型干扰素制剂就得到了很好的效果。

为了扩大干扰素的效力范围，科研工作还在向着研究不同种属动物干扰素间结构、功能及调控因素等方面的关系，力求找到所有动物干扰素的共同点，加以利用开发，争取制备出新型的广谱、高效干扰素临床医用制剂。

干扰素的临床应用（1）疫苗免疫失败后的临床补救治疗。

当错误使用毒力较强的疫苗免疫，或免疫时未察觉鸡群有潜在性疾病感染等情况时，导致疫苗免疫后鸡群出现病症，此时可使用干扰素进行紧急补救治疗，减少损失。

（2）家禽家畜各种病毒性疾病，如猪的口蹄疫、蓝耳病、鸡的新城疫、禽流感、传染性支气管炎等疾病的预防和治疗。

即当发生上述疾病时，在使用其他抗病毒的同时配合使用干扰素，可提高疗效，加速康复。

（3）家禽家畜免疫抑制性疾病，如传染性法氏囊病、马立克氏病、淋巴白血病等的预防注意事项1.本品应在有经验的临床兽医师指导下按规定剂量、疗程和投药途径使用。

2.在使用本品的前后各三天内严禁使用弱毒活疫苗；灭活疫苗不受限制，但不能混合一起注射。

3.本品可同其他抗生素、中药制剂、卵黄抗体同时使用，无配伍禁忌。

4.本品无免疫抑制性，故长期使用不会有耐药性产生。

5.本品饮水给药时，水温不得超过30℃，开瓶一次用完。

6、目前动物干扰素研发存在的问题动物干扰素的临床使用率和医药制剂的研发工作要远远落后于人干扰素的应用和研究，这可能和几个方面有关系：一是成本问题，高纯高效的干扰素制剂其成本较高，对于基层的畜牧业生产者是较重的经济负担；二是干扰素药效持久性问题，干扰素属公泌蛋白，摄入动物机体后，短时间内易被消化降解，造成干扰素的全部疗效还没有发挥出来就已经失效浪费，达不到预期的效果；三是种间差异的限制，研究表明干扰素在同源性方面，不同的动物种间差异较大，而市场上的动物干扰素制剂种类很少，主要是猪、牛干扰素最常见，从而对动物疾病的对种对症治疗带来了限制；四是目前市场上常用的基因工程干扰素医药制剂，虽然在对病毒效价、药力持久性方面都有所改良，但是有资料显示，基因工程干扰素较天然型干扰素更易引发动物机体的抗干扰素中和抗体，从而使干扰素失效，为今后疾病的防治带来困难。

所以，应对这些问题，科研工作者对降低干扰素医用成本、延长干扰素动物体内半衰期、开发更多种动物干扰素医药制剂、减少动物抗干扰素中和抗体产生机率方面的研究应该加大力度。

犬干扰素α的制备及活性测定目的：干扰素α是由脊椎动物细胞产生的一类分泌型糖蛋白它具有广谱抗病毒和增强免疫应答的作用。

干扰素按理化性质可分为α，β和γ三个型，α干扰素是由能在脊椎动物的各种类型的细胞增殖的病毒诱导白细胞产生的其，主要活性是抗病毒，因此制备干扰素α可治疗犬细小病毒病、犬瘟热等高致死性病毒病。

材料和方法：材料：pBV220表达载体,pMD18--T载体,限制性内切酶EcoR,连接酶,大肠杆菌,犬肾细胞,水泡性口炎病毒,伴刀豆球蛋白A,RNA提取试剂盒,M--MLV反转录酶,rTaq酶，及其他相关的实验室设备。

方法：1、根据GenBank中所公布的犬干扰素α的基因序列进行引物设计。

2、犬外周血淋巴细胞的分离培养及总RNA的提取。

3、CaIFN--α cDNA片段的克隆与测序。

4、表达载体的构建。

5、工程菌的诱导表达。

6、表达产物的提取和纯化：包涵体的获得和表达产物的变性复性和纯化。

7、活性的测定：采用细胞病变抑制法进行干扰素α活性的测定方法：采用犬肾细胞--水泡性口炎病毒体系测定干扰素的活性，设空白对照组阳性对照组和阴性对照组。

空白对照组：将犬肾细胞接种于96 孔板。

阳性对照组：将犬肾细胞接种于96 孔板，每孔再加入含水泡性口炎病病毒。

阴性对照组：将犬肾细胞接种于96 孔板，加入倍比稀释的干扰素α作用，每孔再加入含水泡性口炎病病毒。

将以上三组在相同的条件下培养后观察，在阴性对照组的某一孔出现与空白对照组相同，则证明我们所制备的干扰素α可保护细胞不受水泡性口炎病毒的感染，最后我们可输入稀释倍数经软件分析，以便准品测定其生物活性值。

结果讨论参考文献1、王照、夏咸柱等. 动物干扰素的研究进展中国动物检疫20122、李群芳、江宁朋. 细胞因子的研究概况山东畜牧兽医20113、韩森等. 动物干扰素基因工程的研究进展黑龙江畜牧兽医20074、王艳、王海震等. 犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定中国病毒学20055、殷玉和，李莹莹等. 犬干扰素α制备工艺的优化中国兽医杂志社20126、任玉莹, 范泉水等. 基因工程犬干扰素仅的制备及纯化工艺生物技术通讯20097,、殷玉和，李莹莹等. 犬α干扰素的原核表达及活性检测畜牧与兽医20128、陈忠广. 犬干扰素γ的复性及活力测定东北农业大学硕士论文2007。