・学习园地・骨质疏松症动物实验模型的建立和评价赵和平 李 宁 陈 列 宋贵杰甘肃中医学院(甘肃 兰州 730000)关键词 骨质疏松症 动物模型 建立 评价中图分类号:R681 文献标识码:B 文章编号:1005-0205(2001)03-0055-03 骨质疏松症(O steopo ro sis,简称O P)是目前世界人口老龄化重点防治的病症。
按照最新标准, O P可分为三类,原发性O P、继发性O P和特发性O P。
原发性O P是以骨量减少,骨组织显微结构退化(松质骨骨小梁变细、断裂、数量减少;皮质骨多孔、变薄)为特征,以致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身性骨病1。
从目前国内外报道来看,主要以研究原发性O P为主。
实验研究主要包括实验动物的选取、模型的制作方法和观察指标的确定。
现综述如下。
1 模型的建立和观测1.1 大鼠1.1.1 方法 大鼠因其分布广,繁殖快,生命周期短,便于饲养,费用较低,是目前研究O P中使用最多,最成熟的造模动物,且以雌性为主。
造模方法主要有三种,去势法(摘除卵巢或睾丸),维甲酸灌胃法和糖皮质激素肌注法。
此外还有人探讨使用其他方法造模,如用初生大鼠去掉双前肢形成双后肢负重的双后肢造模法2,去势加双后肢造模法2,低钙饲料饲养造模法3,切除甲状旁腺造模法6。
1.1.2 鼠龄 在上述各种造模中,最多使用3至6月龄鼠,也有使用初生鼠2,2月龄鼠19,8月龄鼠19,10月龄鼠29,12月龄鼠7,21,14月龄鼠4,81.1.3 时间 造模时间随造模方法和鼠龄不同而不同。
去势法雌鼠一般3个月,雄鼠3个月29或4个月11。
维甲酸法8天33、14天10、21天9。
糖皮质激素法6周(老龄鼠)5、8周32、18周7。
甲状旁腺摘除法为3个月6。
低钙饲料饲养造模收稿日期:2000-08-28作者简介:赵和平(1965-),男(汉族),甘肃西峰市人,主治医师。
法12周3。
1.1.4 观测指标 大鼠O P造模后,国内学者从各自的研究情况出发,用不同方法对血、尿、骨骼等方面做了深入研究,归纳起来主要有:一是从生物力学方面研究,着重研究骨骼的最大载荷,破坏载荷和能量吸收12,抗弯强度5,33。
二是骨的干重、灰重13,33,骨基质重、骨直径(5)、骨长(L)测量13。
三是骨的超微结构研究,利用扫描电镜和透射电镜观察骨小梁的完整性、空隙大小3,22。
四是骨的整体结构分析,利用骨密度仪测量骨密度(BM D)4,14,33,骨小梁体积(TBV)和平均厚度(M T T)16。
五是骨成份分析研究,包括Ca、P、M g、Zn、Cu,M n含量测定26,33,骨组织中肿瘤坏死因子a(TN Fa)以及雌二醇(E2)测定16。
六是骨组织内雌激素受体(ER)m RNA表达研究15。
七是血尿生化指标测定,包括血清碱性磷酸酶(S2 AL P)、酸性磷酸酶(S2TRA P)2,一氧化氮(N0)、一氧化氮合酶(N0S)8,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(M DA)4、TN F a、E216,血中促甲状腺激素(T SH)、甲状腺激素(T3、T4)17,血清钙(S2 Ca)、磷(S2P)、尿钙 肌肝(U一Ca C r)以及羟脯氨酸 肌酐(U一Hop C r)13。
八是其他方面,包括红细胞膜蛋白激酶C(PKC)和Ca2+2M g2+2 A T P酶活性测定18,大鼠体重19,子宫内膜12和重量变化9,雄鼠前列腺和精囊重量变化及肾上腺和脾脏变化情况101.2 小鼠1.2.1 方法 鼠龄 时间 小鼠是O P实验中使用较少的动物,可能是因其体积小,骨密度测量不方便等原因所致。
从目前所见的资料看,主要有三种方法造模,糖皮质激素法( )34,去势(♀)和维甲酸法23。
鼠龄24月龄34。
造模时间糖皮质激素法12周34去势法4月23维甲酸法255中国中医骨伤科杂志2001年6月第9卷第3期周23。
1.2.2 观测指标 包括骨Ca23,34、微量元素(Zn、Cu、Fe、M n)、计量学23和股骨体积34的测定,血中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH Px)和心肝肾组织中谷胱甘肽(GSH)和脂质过氧化物(L PO)测定23。
1.3 兔1.3.1方法 年龄 时间 使用兔造成O P模型较少,主要用去势法(♀)。
造模时间为5个月31, 6个月30。
兔龄5月,1年31。
1.3.2 观测指示 包括四环素标记观察骨切片计量图象分析30,造模5～8月生存期内测BM D 和体重、毛色、生长状况观察,处死后取骨作生物力学测定,病理组织学检查,骨灰重及灰的Ca、P 含量、子宫重量测量31。
1.4 山羊1.4.1 方法 年龄 时间 山羊在O P实验中尚处于探索阶段。
近年来李良等20选用1.5岁左右山羊(♀),用去势法造模。
1.4.2 观测指标:山羊去势后李氏20从2月起,于不同时间观察髂骨骨活检组织的病理形态学变化;术后3月、6月检测血清骨钙素(B GP)变化,术后6月测长骨生物力学性能。
2 不同模型的特点及评价骨的代谢包括骨的吸收和形成两个方面,若形成大于吸收,则出现骨骼增长、密度升高,反之若吸收大于形成则出现骨密度下降,最终形成O P。
O P的形成需要一个较长时间的骨吸收过程。
在O P实验研究中,由于实验者选用的动物,造模方法,动物年龄的差异,而出现了各个模型之间的差别。
2.1 去势法虽然是目前使用最普遍,最成熟的造模方法,但因选用的鼠龄不同,造模所需时间也不同,有人通过测骨矿含量(BM C)、BM D认为2月龄雌鼠去势后4个月BM C、BM D内无统计学差异,均呈增长趋势;3月龄鼠去势2个月内BM C、BM D基本稳定,只是测量值明显低于阴性对照组;而8月龄鼠在去势1周后,模型组与阴性对照组显示出差异19。
对3月龄雌鼠去势1月后骨呈高转化,3个月骨形成参数有下降趋势,骨吸收增加,骨量丢失,造成O P模型34。
而10月龄的雌、雄大鼠去势3个月后即可满意地显示出O P29。
因此,有人主张用去势法造模时,大鼠宜选用6月龄以上,造模时间至少为3个月25。
由于动物体内骨的组成(密质骨与松质骨含量比)不同,骨骼的负重不同。
因此O P造模后,骨的吸收程度、速度也就不尽相同。
去势后大鼠骨丢失速度为腰椎>胫骨>股骨、腰椎体>胫骨上段>股骨上段27。
2.2 灌服维甲酸法,70m g kg,日1次,连续14日造成O P模型,通过观察胫骨组织形态,显示大鼠松质骨和密质骨量明显丢失,骨小梁密度减少,间隙增大,胫骨中段骨皮质变薄,髓腔扩大;但维甲酸对类骨质形成和骨基质钙化无明显影响。
能使破骨细胞活性与功能显著增强,从而促进骨吸收,使骨代谢处于骨吸收大于骨形成的负平衡状态;同时还观察到大鼠体重减轻,前列腺和精囊重量减少,肾上腺和脾脏肥大,而血中性激素和反映骨代谢状况的生化指标Ca、P及AL P无明显改变10。
胡氏等人亦观察到灌服维甲酸21日后,大鼠的卵巢重量显著减轻,子宫萎缩,骨呈高转化型改变,类骨质增多。
9。
2.3 糖皮质激素肌注法,陈氏等人用老年前期雄性大鼠,肌注0.25m g 100g,周2次,连续6周,通过测全身BM D,骨小梁容积及生物力学抗弯强度,认为建立了O P模型5。
而李氏则肌注氢化泼尼松0.45m g 100kg,周2次,共8周,建立了O P 动物模型,且大鼠S2P及S2AL P活性增加,U2Ca 浓度及24h排泄量增加32。
2.4 对去势法、维甲酸法和糖皮质激素三法,刘氏通过比较研究发现,维甲酸组和去势组鼠骨重(W)减轻,W L,W L5明显降低,形成典型的O P;糖皮质激素组S2AL P、U2Ca C r及U2HO P C r显著升高,但W L,W L5没有明显差异13。
而孙氏研究发现去势小鼠体内的抗氧化物(血中GSH Px和组织中GSH)含量上升,维甲酸小鼠体内的抗氧化物含量下降,两种模型小鼠三种组织中只有肝组织为升高,心肾两种组织L PO含量下降,股骨内微量元素Zn、Cu含量下降,Fe含量上升,M n含量在去势小鼠下降,维甲酸小鼠上升23。
3 小结总之,我国对O P研究虽然比起国外来较晚,但发展较迅速,许多医务工作者用不同方法,从不同角度进行了大量研究,不论从理论方面,还是从临床方面均取得了长足的进展,但还存在不少亟待解决、探讨的问题。
3.1 O P动物造模方法虽有许多,但最成熟、应用最广泛的方法为去势法。
该法是一个比较可靠,符合临床上绝经后妇女O P的病理演变过程但65Ch inese J T rad M ed T raum&O rthop,June2001,V o l9,N o.3用不同月龄大鼠,造模时间不完全相同,一般认为宜使用6月龄以上大鼠,时间至少3个月为宜25。
对于使用不同性别、不同鼠龄造模时间的差异有待深入研究。
3.2 用维甲酸和糖皮质激素造模,存在用药量与造模时间的关系问题,虽然有人做了一定的探讨,还有待深入研究。
3.3 其它几种方法,如低钙饲料饲养法12周3,摘除甲状旁腺3月6,认为即达到了造模目的,但缺乏与其它几种方法的比较,其机理也有待深入研究。
3.4 观察指标上,由于去势法与维甲酸、糖皮质激素法造模动物代谢的不同,出现血、尿生化指标变化上的不同,因此对用不同方法造模适宜检测的生化指标或不适宜检测的生化指标有待深入研究。
3.5 由于骨是一个有机活体,随机体不同部位骨负重不同,构成也不同,在制作O P动物模型中,各骨在各个阶段骨钙的丢失程度不同,固此,测BM D,骨力学性能时对骨骼的取材就比较重要,在判断O P模型制备中,应有一个较为明确的标准,参照执行。
3.6 用其它动物如小鼠、兔、羊造成O P模型研究较少。
3.7 在上述所使用的动物中,普遍存在一个问题,即动物与人的负重方式不同,骨骼系统的结构与人类也不尽相同28。
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