大豆分离蛋白酶解液抗氧化性的近红外光谱定量测定周博1邱智军1（河南科技大学食品与生物工程学院1，洛阳471023）摘要：利用近红外光谱技术对四种蛋白酶（菠萝、碱性、木瓜和中性蛋白酶）的大豆分离蛋白水解样品进行测定，探索同一模型应用于不同酶的水解液抗氧化性测定的可行性。
基于留一交叉验证方法，分析了采样密度和酶物质差异对全波长模型精度的影响，统计检验表明，采样密度与模型精度之间正相关，酶物质差异对单酶样本模型精度无显著影响，但对综合酶样本模型性能有显著影响。
为了建立能够同时准确测定不同酶水解样品抗氧化性能力的综合酶样本预测模型，竞争性自适应重加权抽样（CARS）法用来对模型进行了优化，建模后，校正集R cv和RMSECV分别为0.9601和0.0028，验证集的R p和RMSEP 为0.9237和0.0053，相对分析误差（RPD）为2.45，预测精度较好，说明建立针对不同酶的水解样品的同一模型是可行的。
关键词：近红外光谱竞争性自适应重加权抽样法（CARS）大豆分离蛋白水解抗氧化性偏最小二乘中图分类号：O433.4 文献标志码：A 文章编号：Quantitative Determination of Antioxidant Activity of Hydrolysates from Soy Protein Isolate by Near Infrared Spectroscopy Combinedwith CARSZhou Bo1QiuZhijun1（Henan University of Science and Technology1,Luoyang 471023)Abstract:The hydrolyzed samples of soy protein isolated from four kinds of protease (pineapple, alkaline, papaya and neutral protease) were determined by near infrared spectroscopy and the feasibility of the same model applied to the determination of antioxidant activity of different enzymes was explored. Based on the method of left one cross validation, the influence of sampling density and enzyme substance on the accuracy of full wavelength model was analyzed. The statistical results showed that there was a positive correlation between sampling density and model accuracy. The difference of enzyme material had no significant effect on the accuracy of single enzyme sample model, but it had a significant influence on the performance of the integrated enzyme sample model. In order to establish a comprehensive model of enzyme prediction for simultaneous determination of the antioxidant capacity of different enzymes, the competitive adaptive weighting sampling (CARS) method was used to optimize the model. After modeling, R cv and RMSECV of the calibration set were 0.9601 and 0.0028. R p and RMSEP of the validation set were 0.9237 and 0.0053, and the relative analysis error (RPD) was 2.45. The result showed that the prediction accuracy was good, indicating that it is feasible to establish the same model for hydrolyzing the samples of different enzymes.Key words:Near Infrared Spectroscopy,Competitive Adaptive Reweighted Sampling (CARS),Enzymatic Hydrolysis of Soybean Protein Isolate,Antioxidant Activity, Partial Least Squares (PLS)大豆肽是大豆蛋白经酶水解获得的短肽混合物[1]，也是大豆蛋白开发利用的研究热点。
已发现大基金项目：国家自然科学基金（U1404307）收稿日期：2017-08-30作者简介：周博，女，1992年出生，硕士研究生，食品科学与工程通讯作者：邱智军，男，1978年出生，副教授，食品检测及计算生物学豆肽具有抗氧化、降血压、降胆固醇、降血糖、抗疲劳等生理活性[2-3]。
大豆肽主要有三种工业生产方法：酶解法、微生物发酵法和合成法，其中，酶水解法具有专一性强、条件温和，无毒副作用的特点，而且对营养几乎无不良影响，受到人们的广泛关注[4]。
抗氧化性作为大豆肽诸多生理功能的基础，同时也是其生产制备工艺的重要质量监测指标[5]。
目前抗氧化检测方法很多，且多是化学分析方法[6,7]，其需要耗费大量的人力物力财力，而且耗时长，分析效率低。
近红外光谱技术(NIRS)是近年来发展迅速的一种绿色分析技术，相对于传统分析方法，具有无损样品，成本效益低，劳动效率高等优点[8]，适于大规模产业化生产的在线检测。
目前，在抗氧化检测方面，近红外光谱技术已经被成功地应用到可可豆、绿茶和大米等食品类物质[9-12]。
而以大豆肽抗氧化性为定量检测目标进行近红外光谱建模研究，尚未见报道。
用不同的蛋白酶水解同一种大豆蛋白，其水解产物均具有抗氧化性，但不同蛋白酶作用位点不同，所得水解产物的分子质量以及氨基酸组成不同，从而影响了水解产物的抗氧化活性[13,14]。
为了提高大豆多肽类产品的营养功能和加工特性，多酶复合水解也常用于大豆肽制备[15,16]。
目前在大豆肽工业生产中常用的酶有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，本文拟选取上述四种酶分别对大豆分离蛋白进行水解，对其水解样品进行近红外光谱扫描，以期建立多酶水解液光谱与对应抗氧化值之间的定量分析模型，探索同一模型应用于不同酶的水解液抗氧化性测定的可行性。
1材料与方法1.1 试验材料中性蛋白酶（20万U/g）江苏锐阳生物科技有限公司；碱性蛋白酶（20万U/g）江苏锐阳生物科技有限公司；菠萝蛋白酶（50万U/g）江苏锐阳生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（80万U/g）江苏锐阳生物科技有限公司；大豆分离蛋白（食品级）郑州博研生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）（Biotech Grade）北京Ruitaibio公司1.2 主要仪器VECTOR33傅里叶变换近红外光谱仪德国Brüker公司；DR6000可见光分光光度计美国HACH 公司1.3 试验方法1.3.1样品制备分别用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶促水解。
水解条件分别为其产品说明书最适条件，具体条件见表1，在1h内间隔不同时间取样，每种酶取样29组，共116个样品，分别进行近红外光谱扫描获得光谱数据，同时测定其抗氧化值。
由于操作失误，木瓜酶用于近红外光谱扫描的第28号样品损失，实际用于本研究建模的样品数为115。
表1 四种蛋白酶水解条件酶活/U/g 酶用量/g/g 底物浓度/% 水解条件/℃pH 中性蛋白酶2×1051:20 5 55 7.0～8.0 碱性蛋白酶5×1051:50 5 55 9.0～10.0 木瓜蛋白酶8×1051:80 5 52 6.0～7.0 菠萝蛋白酶5×1051:50 5 38 7.0～8.01.3.2 抗氧化能力测定由于缺乏一种标准方法准确评价抗氧化物质的抗氧化能力，根据不同的目标需要，目前使用的抗氧化测定方法非常多。
本文目的聚焦于探索构建大豆蛋白酶解液抗氧化能力近红外预测模型的可行性，并未全面评价样品抗氧化性，而是选择一种抗氧化研究中最常用的测定方法DPPH法来测定样品的抗氧化能力[17,18 ]。
用DPPH法测定四种酶解大豆蛋白产物的自由基消除量，以此指标作为评价其抗氧化能力的指标。
主要步骤为取1mL样液，加入1 mL的蒸馏水和2 mL配置好的0.004% DPPH溶液，充分混匀，避光静置30 min后，以蒸馏水为阳性对照，甲醇为空白对照，于517 nm波长处测定吸光度。
每一样品重复测定3次，取其平均值。
自由基清除量Y （mg/mL ）按下式计算：12(1)0.08A Y A =-⨯（1）式中：A 1为样品吸光度或阳性对照吸光度，A 2为空白对照吸光度。
1.3.3近红外光谱采集将样品装入样品杯中，采用近红外透射采样系统采集，光谱采集范围为3500～12000 cm -1，扫描次数为32，分辨率为4 cm -1，采用蒸馏水为参比，测量时的环境温度为20 ℃，湿度为35％。
每个样品采集3张光谱，取其平均光谱。
1.3.4全波长光谱和CARS 法波长筛选优化模型构建由于物理变化可能对光谱有影响，因此原始光谱不可避免地包含系统噪声或背景信息[19]。
因此，需要适当的光谱预处理方法来减少不需要的光谱变化。
本研究所有数据均采用Pareto scaling [20]方法进行预处理。
全波长光谱处理建模时，通过对原始光谱进行预处理，利用偏最小二乘留一交叉验证法进行近红外光谱建模，所建模型用相关系数（R ）和均方根误差（RMSECV ）来评价，其中R 越接近1，RMSECV 越小，模型精度越高，预测效果越好。