1 2 3 2 2 1
150030; 2. 中 国农业科学 院农业资 源与农业区 划研究所 , 北
要 : 对从北京周边地区户用沼气池中采集的沼泥进行了富集培养及基因 组 DNA 的提取 , 以古菌和细菌的通用
引物 PCR 扩增 16S rDNA 基因的 V 3 可变区 , 结合应用变性梯度凝胶电泳 ( DGGE) 技术分析沼气池中微生物种群基 因的多样性 , 以及富集前后的微生物群落区系变 化 , 并回收 优势的 DNA 片段 进行序 列分析。结 果表明 , 微 生物群 落在沼气池的不同层次上呈现出 空间分布多样性的差异 , 经过富 集培养 后 , 微 生物种 群的多 样性及 特异性 发生了 很大的差别。序列比对的结果显示, 沼气池中的优势古菌菌群为甲烷鬃菌属 (M ethanosaeta)与甲烷螺菌属 (M ethanosp irillum ), 细菌为梭菌目 (C lo str idiales)和互养菌属 ( Syntrop hus)。经过富集培养 后, 古菌以甲烷八叠 球菌属 (M ethanosarcina mazei)为主 , 细菌除保持了原有的优势菌群外, C 变形菌纲 (Gamma p ro teobacterium ) 也占有绝对的优势。 关键词 : 沼泥 ; 富集培养 ; 微生物多样性 ; DGGE 中图分类号 : Q 939 . 9 ; S216 . 4 文献标识码 : A 文章编号 : 1000- 1166( 2010) 02- 0003- 06
收稿日期 : 2009-12 -15 修回日期 : 2010-03 -02
梯度凝胶电泳 ( DGGE ) 技术由 M uyzer 等 1993 年首
项目来源 : 国家 / 8630重点课题 ( 2007AA 100705) ; 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金课题 ( 中国农业科学院农业资源与农业区 划研究所 2009 -3 ) 。 作者简介 : 宋金龙 ( 1983- ) , 男 , 硕士 , 主要从事农业资源可持续利用方面的研究。
沼气技术在改善农村能源、 环境、 卫生条件等方 面发挥着积极的作用, 是解决我国农村能源危机和 环境污染, 实现农业可持续发展的有效途径
[ 1]
决定其生态功能。利用富集培养技术 , 可以使沼泥 中的微生物群落繁殖加快, 世代周期缩短, 从而使产 气效率大幅提高。因此应用新的技术手段, 全面、 深 入、 准确地了解沼气系统及其富集物中的微生物群 落结构与功能 , 解析富集培养后微生物群落的区系 变化 , 探索产气效率提高的原因, 是突破当前产气率 低、 可控性差, 实现沼气高效发酵、 可控运行的关键, 也是推动我国 沼气应用升级的迫 切要求
[ 4]
L M 引物, T aq 酶 0 . 05 U # LL , 补加灭菌 ddH 2 O 至 50 LL。采用降落式 PCR, 参数为 : 94e 2 m in 30s ;
- 1
94e 30 s, 62e ~ 52e 30 s , 72e 45s , 20 个循环 ; 94e , 30 s, 52e , 30 s , 72e , 45 s , 15 个循环 ; 72e , 10 m in。扩增后, 用 2 % 的琼脂糖凝胶电泳检 -1 测, 在 2 . 0 Lg# mL 的 EB ( 溴化乙锭 ) 液中染色 15 m in , 成像、 观察和分析。然后 , 以在 F357 的 5 . 端设 计了 一 段 含 GC 夹 板 ( GC-clam p ) 引 物 CGC CCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCCTACGGGGYGCASCAG 为 正 向 引 物, R518 为 反 向 引 物 , 进 行 / reconditio ning PCR 0 [ 8] 扩增。反应采用 50 LL 体系, 各组分为 : DNA 模 板 5 LL, 10 @ Load ing Bu ffer 5 LL, 1 . 5 mM 上下游引 物各 0 . 5 LL , M gC l2 4 LL, 0 . 25 mM d NTP 4 LL, T aq 酶 2 U, 补 加灭菌 dd H 2 O 至 50 LL。 PCR 参数为 : 94e , 2 m in 30 s; 94e , 30 s , 52e , 30 s , 72e , 45 s , 3个循环 ; 72e , 3 m in 。 1 . 2 . 4 古菌高变区片段的扩增 选用古菌 V3 区引物 40f( 5. -CCCTACGGGGYGCASCAG-3. ) 和 U529 r ( 5 . -TTACCGCGGCKGCTG3. )。 PCR 反应采用 50 LL 体系, 反应体 系和扩增 参数与细菌 V3区的 PCR 扩增相同。再以 40 f的 5. 端设 计了 一段 含 GC 夹板 ( GC-clam p) 引 物 CGC CCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCCTACGGGGYGCASCAG 为正 向引 物, U529r为反向引物, 进行 / reconditio ning PCR 0 扩增。 1 . 2 . 5 DGGE 图谱及部分优势条带的序列比对分 析 选用通用突变检 测系统 ( BIO-RAD ) 对样品 中 的细菌和古 菌分别 进行 DGGE 分析。细菌 DGGE 的参数为 : 胶浓度: 8 % ; 变性胶 ( 变性剂为去去离子 甲酰胺和尿素 ) 梯度为 30 % ~ 80 % ; 电泳条件: 60e , 60 V, 12~ 14 h 。古菌 DGGE 的参数为 : 胶浓度 : 8% ; 变 性胶 ( 变性 剂为 去去 离 子甲 酰胺 和尿 素 ) 梯度 为 30 % ~ 60 % ; 电泳 条件 : 60 e , 60 V, 12 ~ 14 h。用 SYBR GREEN I 染色后 , 应用 ALPHA 凝胶成像系统 进行观察分析。 1 . 2 . 6 部分优势条带的序列比对分析 在紫外灯下切割含目的 DNA 条带的凝胶块. 转 移到微量 离心管中 , 用吸 头挤碎 , 加 入 ddH 2 O, p H 71 6 溶解 . 重新进行 PCR 扩增 , 扩增后送交英俊公司 测序 , 序列 测序后 去除 载体序 列, 与 G enB ank ( ht tp : / /www. ncb.i u l m. n ih . gov /BLAST ) 数据库中的已
中国沼 气 Ch ina B iogas 2010, 28( 2)
3
沼泥及其富集物中微生物多样性和区系变化的分析
宋金龙 , 阮志勇 , 胡国全 , 姜瑞波 , 刘小飞 , 徐凤花
( 1. 东北农 业大学资源与环境学院 , 黑龙江 哈尔滨 京 摘 100081; 3 . 农业部沼气科学研究所 , 四川 成都 610041)
M icrob ial D iversity and Comm un ity Com position in B iogas S ludge and Its En rich ed Product / SONG Jin - long1 , RUAN Zh i yong2 , HU G uo-quan3, JIANG Rui bo2, L IU X iao-fei2 , XU Feng-hua1 ( 1 . Resources and Environ m en tal College N or theast Agricu ltural Un iversity , H arbin 150030, Ch ina ; 2. In stitute of Agricultural R esources and Regional P lann ing , Ch in ese Acad e my of Agr icu ltu ral Sc iences , B eijing 100081, Ch ina ; 3. B iogas In stitu te of M in istry of Agricu lture , Chengdu 610041 , Ch ina) Abstrac t : G eno m ic DNA w as extracted fro m enr ichm ent o f b iogas sludge wh ich w as co llected from househo ld biog as d igest e rs in surrounding areas o f Be ijing . V 3 va riab le fragm ents o f 16S rDNA gene w ere a m plified by PCR in co m bina tion w ith DGGE techno logy to ana ly ze the g enetic poly m orph ism of m icrob ia l popu lations and the ir var ia tions befo re and afte r enrichm ent , and predom inant DNA frag m ents w ere recovered for sequenc ing . T he resu lts ind icated prom inentm icrob ia l d ive rsity in d ifferen t laye r o f b iogas dig ester , and the m icrob ia l diversity and spec ificity var ied sign ificantly a fter enrichment . Se quence a lignm ent showed tha t the M ethano saeta, M ethanosp irillum, C lostr idiales and Syntrophus w ere the predo m inant popu lations in b iogas digeste rs. A fte r enr ichm ent , the predo m inant popu lations beco m e M ethanosarcina mazei , C lostridiales, Syntrophus and Gamma p roteobacterium . K ey word s : b iogas s ludge ; enrichment culture ; m icrob ia l diversity; DGGE