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恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有永生性和
恶性表型，对此两种来源的细胞系鉴定也是相
似的，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。
一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有
恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细
胞的模型而被应用。
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癌细胞系的建立
癌细胞培养的最主要的问题是从体内到体外环
境的改变。
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癌细胞系的建立
② 肿瘤细胞的自分泌也会因分散培养而被稀释，达不到
肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力。
③ 并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的生命周期， 只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量 很少。 ④ 离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条
件。
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癌细胞系的建立
（一）癌细胞原代培养
这些试验只有采用细胞培养法才能在短期内观察到细胞
的变化，动物试验很难判定药物的直接作用，因此细胞 培养及癌的细胞诱导分化的细胞工程是进行抗癌研究、 癌细胞的恶性逆转研究理想的实验诱导模型。
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5、癌细胞的杀伤效应研究
抗癌的间接效应，往往是药物作用于机体免疫系统促使
免疫细胞发生对肿瘤细胞的特异性和非特异性的免疫应 答，如释放免疫调节因子（如IFN、IL-2等）或细胞毒 因子（LT、TNFα/β），以及激活杀伤肿瘤的淋巴细胞 发挥杀肿瘤效应。
肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、
肿瘤细胞和癌分子生物学极其重要的手段。肿
瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量
的作用。
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1、肿瘤病因和发病机制的研究
体外试验证明了物理因素（如射线）、化学因素（化学
致癌剂）及生物因素（致癌病毒、EB病毒、SV40和多 发瘤病毒等），均能使正常细胞发生转化，致使正常细
胞永生化或恶性化，为癌的诱发因素和环境提供了实验
依据。
环境因素或药物的致畸、致突变研究也可为该环境条件
或药物的致癌性提供实验依据，因此细胞培养是癌的发 生和发展研究的理想实验研究手段。
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2、抗癌药物筛选方面的研究
不同的癌细胞对不同的化疗药物具有不同的敏感性。 采用癌细胞体外培养方法，既可研究某种药物对不同癌
核型、呈异倍体或多倍体等。
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体外培养肿瘤细胞的三个显著
基本特征：
永生性
不受控增殖性 致瘤性
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三、肿瘤细胞系的建立
恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括从人或动
物恶性肿瘤取材建立癌细胞系和正常细胞在体
外经理化、生物因素诱发的转化细胞系。
转化细胞系可以是恶性转化细胞和一般转化细
胞两种。
物上生长。
低血清要求，不依赖生长因子，因其可自分泌产
生促增殖因子。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养
时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
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3、永生性
永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞
可无限传代而不凋亡。体外培养中的肿瘤细胞 系（株）都表现有这种性状。
永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受
细胞的敏感性，为药物抗癌敏感谱提供依据；
同时又可采用某种癌细胞开展对不同药物，不同剂量的
敏感性研究，以筛选出对该肿瘤最敏感的化疗药物和使 用剂量，供人体治疗时参考。
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3、癌基因和抑癌基因方面的研究
实验证明癌的发生和发展与癌基因（原癌基因）和抑癌
基因两种基因的表达调控密切相关。
体外细胞培养既利于测定癌基因及癌基因表达产物，又

用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，
可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次 重复。
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癌细胞系的建立
（5）其它方法
聚丙烯酰胺抑制成纤维细胞生长 密度梯度离心等
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癌细胞系的建立
5、选择性培养基
选择性培养基是针对特殊细胞生长的营养要求
设计的。
在癌细胞建系中，选择性培养基的应用是提高
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癌细胞系的建立
常用酶：
胰蛋白酶是分离细胞最常应用的酶，但它对结缔
组织的消化能力有限，适合含结缔组织较少的肿
瘤，并且对细胞膜有损害作用，影响细胞存活。
胶原蛋白酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细
胞影响不大，适于分离纤维性组织、上皮及癌组
织。
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癌细胞系的建立
胶原酶的消化方法：
0.5mg／ml胶原酶处理，可在显微镜下观 察，纤维细胞逐渐被除去为止。用Hanks液或 培养基洗涤，除去附着细胞的酶，再进行接种
和培养。
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癌细胞系的建立
注意：
当肿瘤组织标本很小，不能用酶消化获取癌细
胞时，可以用组织块法进行原代培养。
癌组织中不可避免有已耗竭和坏死的细胞，在
酶消化前，应尽可能清除，以免接种后很快溶
解破坏，释放出影响癌细胞生长的有害物。
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癌细胞系的建立
3、接种细胞
消化后制备的癌细胞，培养时应有足够的细胞
核型、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性均
不同，这种特性被称为肿瘤细胞的异质性 （heterogeneity）。
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同一肿瘤内细胞的活力有差别，有的细胞衰老
退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增 殖状态的细胞称肿瘤干细胞。只有肿瘤干细胞 才是支持肿瘤生长的成分。
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7、细胞遗传
大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体
密度，通常接种细胞浓度为5×105／ml，37℃ 培养。
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癌细胞系的建立
4、成纤维细胞过度生长的去除
常采用机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、
胶原酶消化法和密度梯度离心法等。
用选择培养基、饲养层等方法可以克服其过度
生长。
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癌细胞系的建立
（1）机械刮除法
将玻璃吸管前端在火焰上烧弯曲，用作除去成纤 维细胞的工具。可在显微镜下直接刮除生长的成纤维 细胞，也可事先在显微镜下对有成纤维细胞生长的单 层培养瓶上做出标记，然后按标记刮除。刮除后，用 培养液洗1~2次后，加入新培养液培养。如需要可多次 刮除。
可以测定抑癌基因的表达水平。癌细胞的体外培养是定 量研究癌基因和抑癌基因表达调控的理想工具。
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4、癌细胞的诱导分化和逆转方面的研究
血癌往往是由低分化的幼稚细胞的单克隆恶性增生所引
起，若将血癌的体细胞通过体外诱导分化，促使向终未 细胞分化成为功能性血液细胞，这就可使血癌患者获得
完全缓解或达到治愈的目的。
肿瘤细胞的培养
安徽医科大学微生物学教研室
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内容纲要
肿瘤细胞体外培养的重要性和应用 体外培养肿瘤细胞的特征
肿瘤细胞系的建立
癌细胞系的建立
转化细胞系的建立
癌细胞系和转化细胞系的鉴定
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一、肿瘤细胞体外培养的重要性和应用
肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，当前
建立的细胞系中癌细胞系是最多的。
化疗情况，为细胞建系的重要材料。
为了鉴定建立的细胞系来源和生物学特性，最
好留有病人正常组织和血标本。
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癌细胞系的建立
2、分离
单纯的机械方法分离如吹打和过滤对癌细胞损
伤小。有些肿瘤如人卵巢癌、某些神经胶质瘤
可采用。
癌组织多为较坚实的实体，肿瘤细胞包埋在大
量的纤维基质中，难以进行机械分离。因此酶 消化法是分散癌细胞的好方法。

培养。

用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过 几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
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癌细胞系的建立
（4）胶原酶消化法
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，
通过消化进行选择。

可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显 微镜下观察，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消 化；
这种效应均可通过体外杀肿瘤细胞试验来证实，取同体
淋巴细胞经体外培养后，并加入IL-2/IFN-γ等，能明显 增强NK、TCL、LAK和TIL杀肿瘤活性。经扩增达一定 数量后再回输给病人，其疗效明显。
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二、体外培养肿瘤细胞的特征
肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体 内或在体外，在形态、生长增殖、遗传性状等 方面都有显著的不同。
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5、浸润性
浸润性是肿瘤细胞的扩张性增殖行为，培养癌
细胞仍持有这种性状。
在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织
细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。
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6、异质性
通过肿瘤细胞培养及克隆分析发现，同一肿瘤
是由具有不同生物学特征的细胞亚群构成的。
这些细胞亚群的浸润性、生长率、转移能力、
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癌细胞系的建立
（3）消化排除法

先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗 培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在 倒置显微镜下观察和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落 下来后，便立即停止消化；
把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加 培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续
不同基因调控。从一些具有永生性而无恶性的
细胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞可以
证明。
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4、致瘤性
细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反
映细胞恶性程度的指标。
具体做法是：
1）收集培养的肿瘤细胞，用无血清培养液洗一遍；2）计数 后将0.2ml含2×106～2×107个细胞的细胞悬液注射到动物皮下。 约一个月左右（最短在3天后），可见注射局部有肿瘤出现，甚至 有转移瘤形成。经病理组织学检查可以确定肿瘤是否由接种的细 胞产生。也可接种到腹腔或通过鼠尾静脉注射。