外源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤: （1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有酵母启动 子和转录终止子的表达框中； （2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产物； （3）外源蛋白在特定培养条件下合成； （4）外源蛋白的纯化与及其天然产物的比较。
3.2 高效表达特性 整合型表 达载体 表达载体 甲醇氧化酶启动子 pAOX1
抑制基因
大肠杆菌表达系统
是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列 使转录在目的基因之后立即停止，避 免多余的转录以节省宿主内RNA的合成 底物，提高目的基因的转录量 防止产生不必要的转录产物，控制目 的基因mRNA的长度，提高 mRNA稳定性， 避免质粒上其它基因的异常表达
终止子
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 外源目的基因的转录系统
蛋白质的翻译系统
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 复制子 选择标记
大肠杆菌表达系统 是一段包含复制起始位点和反式因子 作用区的DNA片段。 大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表 达载体，有效的复制子包含在质粒中
基 因 表 达 系 统
原核生物表达系统

外源基因
原核生物细胞 基因产物
原核生物表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
原核表达载体
大肠杆菌 芽孢杆菌 链霉菌 蓝藻
原核生物表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
原核表达载体
大肠杆菌
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
酵母表达系统的优点：
A.可以大规模生产，有效降低了生产成本 B.收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工 和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳 定 C.很容易纯化
2.酵母表达系统的组成
宿主 自主复制型质粒 质粒载体 选择标记
外源基因表达的相关元件
3.主要酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 乳酸克鲁维亚酵母表达系统 甲醇营养型酵母表达系统 裂殖酵母表达系统
(一)以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系
多数杆状病毒表达载体的构建过程大体如下：
① 将目的基因克隆入合适的转移载体
② 用重组的转移载体和相应的野生性或改造过的野
生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞
③ 用噬菌斑分析分离并鉴定阳性重组体
④ 扩增病毒以进行大规模的蛋白生产
⑤纯化所表达的外源蛋白
多核多角体病毒(MNPv)是应用最广的杆状病 毒载体
高效产 生的关 键因素
醇氧化酶-1（AOX1） 的终止子3’AOX1 酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列
受体菌：蛋白水解酶缺陷型
甲醇营养型酵母表达系统的主要优点：
A.应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控 B.表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高度 发酵,产量高 C.表达产物分拣进入过氧化物酶体,利于工业生产和 分离纯化 D.对分泌蛋白的糖基化修饰和糖基化程度适中
复制子
选择标记
使转化体产生新的表型，以便于将转 化了的细胞从大量的菌群中分离出来
大肠杆菌表达系统
氨苄青霉素抗性 四环素抗性 链霉素抗性 氯霉素抗性 卡那霉素抗性 选择标记
显性标记
营养缺 陷标记
使转化体产生新的表型，以便于将转 化了的细胞从大量的菌群中分离出来
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
• 该病毒基因组为共价闭合环状双链DNA，长80～200kb， 1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配 2，具有与高等生物相似的蛋白翻译后的加工修饰能力
3，表达水平高，可达总蛋白量的50%；
4，可容纳大分子的插入片段； 5，能同时表达多个基因。
外源蛋白的表达的影响因素
• 高质量的培养基是获得高效表达的前提，
拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的
载体系列
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2013.01.08
植物表达载体 Ti质粒表达载体
Ti质粒
• Ti质粒 为植物根癌土壤杆菌菌株中存在的 质粒，其特定部位与植物核内DNA组合来 表达信息，使植物细胞肿瘤化。Ti质粒是 在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体 外自主复制的环形双链DNA分子。它控制 根瘤的形成，可作为基因工程的载体。 • 农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列,可以从农 杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。 这段DNA序列叫做T-DNA序列。
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 外源目的基因的转录系统
启动子 抑制基因
终止子
大肠杆菌表达系统 是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别 和结合并指导目的基因转录的DNA序列 启动子 种类: 诱导型启动子,Lac、Trp、λ PR tra组成型启动子,T7噬菌体的启动子 是一种控制启动子功能的蛋白质，对 启动子的起始转录功能产生抑制作用 在适当的诱导条件下可使抑制物失活， 启动子功能重新恢复。
3.1甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和碳源 表达载体：整合体型载体 筛选标记：组氨醇脱氢酶 基因HIS4 启动子：AOX1 作为分泌型表达时，外 源基因需要接上一段信号 肽序列
我国酵母表达载体产品结构分析
毕赤酵母系统模式表达载体
5’AOX1 启动子片段含有AOX1启动子， 在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达; α -因子信号肽序列为约89个氨基酸的 信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上 清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基 因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修 饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3’AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基 因同源重组； 抗Amp基因和pBR322复制起始位点，使 载体可在E.coli中筛选和复制。
A：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工 B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复 杂的复性才能恢复构象和活性 C：背景杂蛋白很多、纯化起来麻烦 D：表达量一般不是很高
1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点， 发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵 母。 1981年,Hizeman等人首次报道了人重组干扰 素基因在酿酒酵母中表达并获成功。
起始密码子
终止密码子
优势
劣势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读
框架
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
基因克隆表达系统成熟完善
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传 源蛋白
稳定
已发展为一种安全的基因工程实验体系，
细胞周质内含有种类繁多的内毒素
蛋白质表达系统的选择
大肠杆菌表达系统
基因表达系统
DNA
调控 RNA 翻译 中心法则
蛋白质
基因表达系统
DNA
RNA 翻译
蛋白质
基因表达系统
基因表达系统
基 因 表 达 系 统
原核生物表达系统 真核生物表达系统
酵母 植物 昆虫 哺乳动物细胞
... ...
其它
无细胞系统 胚细胞
... ...
基因表达系统
• 农杆菌侵染植物后， Ti 质粒中的 T-DNA 区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体 上。因此，如果把外源基因插入 T-DNA 中， 就有可能携带进入受体植物并整合到染色 体上。 • 农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为 植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁 香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可 以诱导Vir（Virulence region)基因的启动 表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－ DNA 单链切下，而位于根瘤染色体上的操 纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形 成复合物，转化植物根部细胞。
昆虫细胞培养要求相对较高的氧浓度，应
使细胞具有高度活性并维持在对数增长期。
除此之外，使用的载体、启动子、前导肽
以及所表达外源基因的特性也会对表达水
平产生影响。
（二）稳定转化的昆虫表达系统
酵母表达系统
Concept
1
酵母表达系统的产生
2
3 4 5
酵母表达系统的组成
主要酵母表达系统 不同酵母表达系统的特点 酵母表达系统的方法
1.酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成 和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期 以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多 种蛋白。
大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：
农杆菌感染植物细胞的方法
• （1）叶圆片法：用打孔器打取几毫米直径 的叶圆片，表面消毒，进入农杆菌液数秒 后，置于适当培养基上培养2天，，再转到 含有卡那霉素和羧苄青霉素的选择培养基 上培养20天，通过脱分化、再分化长成新 的含有目的基因的植株。
• （2）整株感染：在无菌培养的整株植 株的适当部位上人工造成伤口，用农 杆菌液接种，待形成肿瘤后切下，在 含有抗生素且无激素的培养基上进行 培养并除菌。 • （3）原生质体和农杆菌共培养法：将 除去细胞壁的原生质体与农杆菌共培 养，然后再分化细胞壁、脱分化、再 分化得到含有目的基因的植物植株。
甲醇营养型酵母表达系统的主要不足： A.甲醇不适于食品工业生产 B.易发生火灾
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昆虫表达系统 Insect Expression
昆虫表达系统
• 用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白目 前应用较多，对果蝇等昆虫进行稳定转化后可以 获得稳定性和表达效率方面更为优异的表达系统。 • 目前已经利用昆虫表达系统成功地表达了鼠源单 克隆抗体、人一鼠嵌合抗体、单链抗体、人单克 隆抗体及抗体融合蛋白等基因工程抗体分子，这 些抗体分子多数能正确组装，完成糖基化过程， 具有相当的活性。
Ti质粒的转化过程
T-DNA的边界