复里亏提（医学版） Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖ Ｊ Ｍｅｄ ｓｃｉ １６９
乳腺癌基因芯片数据分析 蒋定锋 高 峻 赵耐青 （复旦大学公共卫生学院卫生统计与社会医学教研室 上海２０００３２）
【摘要】 目的以乳腺癌病人的表达谱芯片数据为基础，探寻乳腺癌复发的相关基因。方法对标化芯片数据 进行缺失值处理后，分别用单因素ＣＯＸ回归模型和综合了聚类及多因素ＣＯＸ回归的综合法来筛选兴趣基因， 然后通过兴趣基因对病人做样品聚类，以灵敏度、特异度、约登指数和Ｋａｐｌａｎ．Ｍｅｉｅｒ法评价分类效果，最后结合 文献和蛋白质数据库探寻乳腺癌复发的相关基因。结果综合法筛出的３Ｏ个Ｐ＜０，０１的基因对乳腺癌病人复 发状况的预测效果最佳；单因素ＣＯＸ回归筛出的１０２个Ｐ＜０，０１的基因的预测效果较差；单因素Ｃ０Ｘ回归筛 出的１５个Ｐ＜０．００１的基因预测效果最差。结论综合法筛选得到的３Ｏ个基因可用来评价病人的预后状况， 为进一步的生物学研究提供待选基因。 【关键词】乳腺癌； 基因芯片； 聚类分析； ＣＯＸ回归模型 【中国图书馆分类法分类号】Ｒ ７３７．９，０ ２１２，１
Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ＪＩＡＮＧ Ｄｉｎｇ—ｆｅｎｇ，ＧＡＯ Ｊｕｎ，ＺＨＡＯ Ｎａｉ—ｑｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｏｃｉａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｄｍｏｌ ｏｆＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２，Ｃｋｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｐｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎ． ｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ ＣＯＸ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ ｔＯ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ．Ｓｅｃｏｎｄｌｙ，ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ｏ０Ｘ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ，Ｔｈｅｎ Ｋ—ｍｅａｎｓ ｃｌｕｓｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔＯ ｃｌａｓ— ｓｉｆｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｐｓｅ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｙｏｕｄｅｎ’Ｓ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ・Ｍｅｉｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔＯ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ３０ ｇｅｎｅｓ（Ｐ＜０．０１）ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｂｅｓｔ ｗｈｅｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｐｓｅ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｔｈｅ １０２ ｇｅｎｅｓ（Ｐ＜０． ０１）ｂｙ ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ ＣＯＸ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｗｅｌｌ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ １５ ｇｅｎｅｓ（Ｐ＜０．００１）ｂｙ ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ ＣＯＸ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｗｏｒｓｔ， Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ３０ ｇｅｎｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｐｉｃｋｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｒｅ ｗｏｒｔｈｙ ｏｆ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｔｏ ａ＆ｓｅｓ８ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔＳ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ；ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ；ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣＯｘ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ
乳腺癌是西方女性的高发肿瘤。在我国发病率 也逐年升高，尤其在京、津、沪等沿海发达地区，其中 以上海最高，１９９７年发病率为４９／１０万，居女性恶 性肿瘤的首位…。 目前具有相同症状及病理类型的患者经过相同 治疗后，在预后上存在极大差别。这说明当前乳腺 癌的分类标准有待提高，同时提示病人内在的基因 表达对病人的预后具有重要意义。基因芯片能同时 检测数千个基因的表达，了解病人特异的表达谱，为 通讯作者Ｅ ｍａｉｌ：ｎｑｚｈａｏ＠ｓｈｍｕ ｅｄｕ ｃｎ 系统研究乳腺癌预后的相关基因提供了技术保证， 从而成为乳腺癌研究领域的一种常规技术。 如何对芯片产生的海量数据进行分析，以获得 有效的生物学信息来指导后续研究是乳腺癌研究的 重点和难点。我们利用Ｃｈｒｉｓｔｏｓ等 ｊ提供的数据， 综合运用聚类和ＣＯＸ回归模型两种方法来筛选乳 腺癌复发的相关基因。为了克服多重比较导致假阳 性增大的危险，本研究对Ｐ值进行了控制。该芯片 数据包括９９个病人的乳腺癌样品的７６５０个探针，
维普资讯 http://www.cqvip.com １７０ 复旦学报（医学版）２００５年３月，３２（２） 其数据矩阵为９９×７ ６５０，并且已知９９个病人的其 他信息如复发与否、复发时间和失访时间等。 材料和方法 缺失值的处理 对缺失少于１／３的标化探针数 据（即至少有６６个病人有该探针数据）共７ ４７５个 探针进行缺失值处理。７ ４７５个探针中４ ４０４个无 任何缺失，而其他３ ０７１个则有不同程度的缺失。 将３ ０７１个探针分别作为应变量，４ ４０４个探针为待 选自变量，利用ＳＡＳ软件用多元逐步回归法填充缺 失值，采用前进法，人选标准ａ＝０．００１，控制模型变 量个数。 单因素ＣＯＸ回归分析 对７ ４７５个探针进行 单因素ＣＯＸ回归分析，乳腺癌复发定义为失效事 件，结果有１５个探针的Ｐ＜０．００１，将对数风险函数 的预测值定义为Ｙ１ ＝Ｚ （ｉ＝１，２…１５）；同时有 １０２个探针的Ｐ＜０．０１，将对数风险函数的预测值 定义Ｙ２，＝Ｚ （ｊ－＝１，２…１０２）。 综合法分析 用单因素ＣＯＸ回归分析对７ ４７５ 个探针进行初筛，乳腺癌复发定义为失效事件，人选 标准ａ＝０．１，共有８１６个探针入选。对８１６个探针 用层次聚类法聚类，组间连接法，Ｐｅａｒｓｏｎ相关系数 为指标，聚成２Ｏ类。然后用多因素ＣＯＸ回归模型 对每一类来筛选兴趣探针，采用逐步回归法，人选标 准Ｐ＝０．０１，移出标准Ｐ＝０．０１１。结果２０类中有 ７类无一个探针符合人选标准，其余１３类中共有３０ 个探针符合标准。将３０个探针所在１３个类的对数 风险函数预测值定义为Ｙ３女＝ （ｋ＝１，２…１３）。 Ｋ．Ｍｅａｎｓ聚类 分别以单因素ＣＯＸ回归分析 得到的线性预测值ｙ１ （ｉ＝１，２…１５）、ｙ２，（ｊ＿＝ １，２…１０２）和综合法得到的线性预测值 （是＝１， ２…１３）为应变量，用Ｋ．Ｍｅａｎｓ聚类法对９９个病人 进行聚类，分成２类。 效果评价对３个聚类结果分别与病人的实际 复发状况比较，计算灵敏度、特异度和约登指数，然 后以预测分类结果为分组变量；用Ｋａｐｌａｎ—Ｍｅｉｅｒ法 对病人的复发时间作生存分析，评价不同方法得到 的１５、１０２和３０个兴趣探针的分类效果，结合文献 报道探寻乳腺癌复发的相关基因。 结 果 以Ｙｌ 、Ｙ２ｊ和ｙ３女为指标做样品聚类后，分类 和实际复发情况见表１～３。 由表１～３可见以 ３女为指标作分类，其预测效 果最佳、 ２，次之，ｙ１ 最差。
表１ Ｙ１ 为指标聚类后结果 Ｔａｂ １ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ Ｙｌｉ Ｔｈｅｐｒｅｄｉ ｃ ｔｅｄｓｔａｔｕｓｏｆｔｈｅｐａ ｔｉｅｎｔｓ
Ｔｈｅ ｒｅａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｎｏｔ ｒｅｌａｐｓｅ： Ｒｅｌａｐｓｅ：，Ｓ￣ｒｎ ｒ１ｌ１ ｔＰｒ １ ｒ１１ ｌｓｔＰｒ ２
Ｎｏｔ ｒｄａｐｓｅ：０ Ｒｅｌａｐｓｅ：１ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａ１） Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ（９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａ１） Ｙｏｕｄｅｎ’Ｓｉｎｄｅｘ ４３ １１ ５４ １９ ２６ ４５ ６２ ３７ ９９ ２６／４５＝０ ５７８（０ ４２２—０ ７２３） ４３／５４：０ ７９６（０．６６５—０ ８９４） ０ ５７８＋０ ７９６—１＝０ ３７４
Ｎｏｔｅ：Ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ １５ ｐｒｏｂｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ ＣＯＸ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｐ＜ ０ ００１）
表２ Ｙ２ 为指标聚类后结果 Ｔａｂ ２ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ Ｙ２］ Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉ ｃ ｔｅｄｓｔａｔｕｓｏｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓ
Ｔｈｅ ｒｅａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ Ｎｏｔ ｒｅｌａｐｓｅ： Ｒｅｌａｐｓｅ：，Ｓ￣ｒｎ ｄｕｓｔｅｒ１ ｃｌｕｓｔｅｒ ２
ＮＯｔ ｒｄａｐａｅ：０ Ｒｅｌａｐｓｅ：１ Ｓｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａ１） Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ（９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａ１） ＹｏｕｄｅＦｌ’Ｓ ｉｎｄｅＸ ３８ １６ ５４ ６ ３９ ４５ ４４ ５５ ９９ ３９ ５＝０ ８６７（０ ７３２—０ ９４９） ３８／５４＝０ ７０４（０ ５６４—０ ８２０） ０ ８６７＋０ ７０４—１＝０ ５７１ Ｎｏｔｅ：Ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ １０２ ｐｒｏｂｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ ＣＯＸ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｐ＜ ０．０１）
表３ Ｙ 为指标聚类后结果 Ｔａｂ ３ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ Ｙａｋ Ｔｈｅ ｐ ｒ ｅｄ ｉｃｔｅｄｓｔａｔｕｓｏｆ ｔｈ ｅｐａｔｉｅｎｔｓ
Ｔｈｅ ｒｅａｌ Ｓｔａ￣Ｓ ｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ Ｎｏｔ ｒｄａｐａｅ： Ｒｅｌａｐｓｅ：，Ｓ￣ｒｎ ｃｌｕｓｔｅｒ １ ｃｌｕｓｔｅｒ ２
ＮＯｔ ｒｅｌａｐｓｅ：０ Ｒｅｌａｐｓｅ：１ Ｓｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｃａｔ） Ｓｐｅｃ ｆ ｃｉｔｖ（９５％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａ１） Ｙｏｕｄｅｎ’Ｓ ｉｎｄｅｘ ４６ ８ ５４ ６ ３９ ４５ ５２ ４７ ９９ ３９／４５＝０ ８６７（０ ７３２—０ ９４９） ４６， ４＝０ ８５２（０ ７２９—０ ９３４） ０ ８６７Ｉ｝０ ８５２—１＝０ ７１９