成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序
溶液配方：
1. 无钙台式液（含5%CO2的氧气饱和30min,NaOH调节pH 7.35-7.4 ）
MW mM
g/L
g/100mL
g/200mL g/500mL
NaCl
58.44 143 8.3569 0.8357 1.6714 4.1785
KCl
74.55 5.4 0.4026 0.0403 0.0805 0.2013
MgCl2.6H2O
203.21 0.5 0.1017 0.0102 0.02 0.0509
NaH2PO4 .2H2O
155.98 0.33 0.0515(0.0468) 0.0052 0.01 0.0258
BDM
D-glucose（用时加）
180.2 5 0.9909 0.0991 0.1982 0.4955
去离子水
1000mL
2.
台式液（含5%CO2的氧气饱和30min,NaOH调节
pH 7.35-7.4）
MW mM g/L
g/100mL g/200mL g/500mL
NaCl 58.44 136.9 8.0004(8.3569) 0.8 1.6 4
KCl 74.55 5.4 0.4026 0.0403 0.0805 0.2013
CaCb 110.98 1.8 0.1998 0.02 0.02 0.1
MgCl2.6H2O 203.21 0.5 0.1016 0.0102 0.0203 0.0508
NaH2PO4 .2H2O2 155.98(156.01) 0.33 0.0515(0.0468) 0.0051 0.0103 0.0257
BDM
D-glucose 180.2(198.17) 10(5) 1.802(0.9909) 0.1802 0.3604 0.901
去离子水
1000mL
3. KB 液(含 5%CO2 的氧气饱和 30min,NaOH 调节 pH 7.35-7.4)
MW mM g/L
g/100mL g/200mL g/500mL
KCL 74.55 ；25 [1.8638 0.1864 0.3728 0.9319
Tauri ne（
牛
磺 酸
）
125.15
20
2.5028 0.2503 0.5006 1.2515
L-Glu 147.13 ：70 M0.2991 1.03 2.0599 5.1496
KH 2PO4 136.09 10 1.3609 0.1361 0.2722 0.6805
MgCL2.6H2O 203.21 3 0.6096 0.0610 0.1220 0.3048
EGTA
（钙螯
合剂）
380.35 0.5 0.佃01 0.0190 0.0380 0.0951
D-glucose 180.2 10 1.802 0.1802 0.3604 0.901
BDM
去离子水
1000mL
4. 酶液：（NaOH 调节 pH 7.35）
4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]
100mL酶液A:胶原酶I +胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collage nasel +6mg
胰
蛋白酶
45mL酶液B： 45ml无钙台式液 +18mg collagenasel
4.2 [王振国.四医大硕士论文。 2005]
30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg胶原酶I +21mg BSA
5. 复钙液（NaOH调节pH 7.35）
5.1
20mL 复钙液 A: 20mL 无钙台式液 +10mgCaCI2+20mg BSA
。
20mL复钙液 B: 20mL无钙台式液 +20mgCaCI2+20mg BSA
。
20mL复钙液 C: 20 mL台式液 +20mg BSA
。
5.2
100mL 复钙液 A: 100mL 无钙台式液 +1.1mgCaCI2, 100mg BSA
。
100mL 复钙液 B: 100mL 无钙台式液 +5.5mgCaCI2, 100mg BSA
。
50mL复钙液 C: 50 mL台式液 +50mg BSA
。
5.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]
复钙液A:取无钙台式液加入CaCI2至0.1mmol/L,BSA至
1 mg/ mL
复钙液B :取无钙台式液加入CaCl2至0.5mmol/L, BSA至
1 mg/mL
复钙液C:取台式液加入BSA至1 mg/ mL。
6.
心肌细胞分离
其步骤简述如下：
1. 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg
体重）
2.
迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中,使心脏剧烈收缩排出心腔内
残留的血液，然后迅速将心脏固定于 Lan ge ndorff灌流系统上。
3. 经主动脉灌流（37T
）含氧无钙台式液
4. 心脏停跳后，换以含胶原酶I（ 0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L
）的无钙 台式
液灌流约
10min
5.
心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶 液约
2min。
6. 去除新房及主动脉，并将心室组织置于含 2%BSA的含氧KB （37C）
液中。
7. 将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经 200
目筛网过滤细胞悬液。
8. 室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100X离心5min
），保留沉淀并换入 新
鲜含2%BSA的KB液。
9. 静置40min后逐步复钙至终浓度1.8X 10-3mol/L （一说1.25X 10-3mol/L），
得
到钙 耐受心室肌细胞，保存于含1.8 X 10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。
另一说 ：
8. 250目尼龙网过滤，静置10min,弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙 15min
（ 使心肌细胞自然沉降 ） ，弃上清液后加入复钙液 B 5mL 静置复钙 15min
， 弃上
清加入复钙液C,静置15min备用。
9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+荧光探针染色，500此台式液加1让DMSO
（二甲 基亚
砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上 仪器检
测。
注意事项：灌流消化过程中维持7.5~ 10.0 kPa的压力,所有液体均用0.22卩n滤器
过滤除菌且用体积分数95%的02+体积分数5%的CO2混合气体饱和，灌流温度 保持在
35C,实验室温度保持在20-30Eo