ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路在ＴＧＦ－β１诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

胡永亮刘真焦大凯马恬王常勇贾赤宇

目的　观察ＴＧＦ－［１对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶 信号通路的影响，以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法　原代培养人皮 肤成纤维细胞，将第４代细胞用ＴＧＦ－β１（　１０　ｎｇ／ｍｌ）刺激后，分不同作用时间（０、３、６、２４ｈ）提取细胞 内总蛋白。ＢＣＡ法测定总蛋白浓度，Ｗｅｓｔｅｒｎ　－ｂｌｏｔ检测α－ＳＭＡ的表达水平；并用相同的方法检测不 同浓度ＴＧＦ－β１（０、２、１０、５０　ｎｇ／ｍｌ）刺激人皮肤成纤维细胞后，α－平滑肌肌动蛋白（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　 ａｃｔｉｎ，α－ＳＭＡ）的表达水平。用ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路阻断剂Ｙ－２７６３２处理后，再用ＴＧＦ－β１刺激， 作为实验组，将未作处理的正常细胞作为空白对照组，Ｙ－２７６３２（１０　μｍｏｌ／Ｌ）组作为阴性对照组，只 用ＴＧＦ－β１（　１０　ｎｇ／ｍｌ）刺激组作为阳性对照组，分别检测α－ＳＭＡ的表达差异。使用ＡＮＯＶＡ对蛋白 表达量进行统计学分析，Ｐ　＜０．０５为差异有统计学意义。结果 １０　ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ－β１按不同作用时间 刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０ｈ为１．０，３ｈ为１．９＋０．２、６ｈ为２．１±０．１， ２４　ｈ为３．１±０．１。２４　ｈ较其他３个时间点α－ＳＭＡ表达量明显上升（ｎ＝４，Ｐ＜０．０５）。不同浓度 ＴＧＦ－β１刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０　ｎｇ／ｍｌ为１．０，２　ｎｇ／ｍｌ为１．４±０．２， １０　ｎｇ／ｍｌ为３．２±０．１，５０　ｎｇ／ｍｌ为３．１±０．２。１０　ｎｇ／ｍｌ表达量明显高于０　ｎｇ／ｍｌ和２　ｎｇ／ｍｌ（ｎ　＝４， Ｐ　＜０．　０５），较５０　ｎｇ／ｍｌ差异无统计学意义（ｎ＝４，Ｐ＞０．０５）。用Ｙ－２７６３２（１０　μｍｏｌ／Ｌ）处理后，再用 ＴＧＦ－β１刺激，细胞的表型转化明显受到抑制，实验组α－ＳＭＡ的表达量（１．２±０．２）较阳性对照组 （２．９±０．１）明显降低（ｎ＝５，Ｐ　＜０．０５），与空白对照组（１．０）和阴性对照组（１．１±０．１）相比差异均 无统计学意义（ｎ＝５，Ｐ＞０．　０５）。结论　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路参与了　ＴＧＦ－β１诱导的人皮肤成纤 维细胞表型转化过程。

成纤维细胞； ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路；转化生长因子β１； α－平滑肌肌动蛋白

Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｎ　ＴＧＦ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ＨＵ　Ｙｏｎｇ－ｌｉａｎｇＬＩＵ　ＺｈｅｎＪＩＡＯ　Ｄａ－ｋａｉ

ＭＡ　ＴｉａｎＷＡＮＧ　Ｃｈａｎｇ－ｙｏｎｇ

ＪＩＡ　Ｃｈｉ－ｙｕＣｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　ａｎｄ　Ｂｕｒｎ　Ｒｅｐａｉｒ，　３０９　ｔｈ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ＰＬＡ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，　Ｃｈｉｎａ　

１０．　３７６０／ｃｍａ．　ｊ．　ｉｓｓｎ．　１００９－４５９８．　２０１１．０５．　０１５国家自然科学基金（３０７７２２５９）

作者单位：１０００９１　北京，解放军第３０９医院整形美容烧伤修复中心（胡永亮、刘真、马恬、贾赤宇）；军事医学科学院基础医学研究所组织工程研究室（王常勇）；航空工业中心医院整形外科（焦大凯）

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｎ　ＴＧＦ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ　４ｔｈ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－β１　（１０　ｎｇ／ｍｌ）．　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　α－ＳＭＡ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－β１　ｆｏｒ　０，　３，　６，　ａｎｄ　２４　ｈ．　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔ－ＳＭＡ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ－β１　（０，　２，　１０，　５０　ｎｇ／ｍｌ）． Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　

ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　（４ｔｈ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）　ｗｅｒｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－３１　（　１０　ｎｇ／ｍｌ）　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｙ－２７６３２　（ｌ０ｕｍｏｌ／ｍｌ）． Ｔｈｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｔｈｉｎｇ　ａｓ　ｓｈａｍ　ｃｏｎｔｒｏｌ，　ｏｒ　ｗｉｔｈ　Ｙ－２７６３２　（１０ｕｍｏｌ／Ｌ）　ｏｎｌｙ　ａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，　ｏｒ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－β１　（１０　ｎｇ／ｍｌ）　ｏｎｌｙ　ａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　α－ＳＭＡ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ａｌｌ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　

万方数据ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＮＯＶＡ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｗｉｔｈ　１０　ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ－β１　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　０，　３，　６，　２４　ｈ　ｗａｓ　１．０，　１．９　＋０．２，　２．　１　＋０．　１，　３．１　＋０．　１，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　２４　ｈ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ　（　ｎ　＝　４，　Ｐ　＜　０．　０５　）．α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ－β１　（　０，２，　１０，　５０　ｎｇ／ｍｌ）　ｗａｓ　１．０，　１．４　±０．　２，　３．２　±０．　１，　３．１　±　０．　２，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　１０　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　２　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　ｎ　＝　４，　Ｐ　＜　０．　０５　）．　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１０　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　５０　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　（ｎ　＝４，　Ｐ　＞０．　０５　）．　Ｗｉｔｈ　ｂｏｔｈ　Ｙ－２７６３２　（１０　μｍｏｌ／Ｌ）　ａｎｄ　ＴＧＦ－β１　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　（　１．２　±　０．　２　）　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅｄ，　ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　２．　９　±　０．　１　）　（　ｎ　＝　５，　Ｐ　＜　０．　０５　）．　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　（　ｎ　＝　５，　Ｐ　＞　０．０５　）　ｉｎ　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　１．０　）　ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　１．１　±０．　１　）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ＴＧＦ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ； ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ； Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ１　；α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ　

万方数据・３７８・史！￡鳖丝丛ｉ±盘查！！！！篁！旦笙！！鲞箜！塑￡！ｉ！：！！堕！！！！些！！！Ｐ：垫！！！∑！！：！！！盟！』

缓冲液清洗２遍，然后用细胞裂解液ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ

（１０ｍｍｏＬ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、

１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００、１０ｎｇ／ｍｌＡｐｒｏｔｉｎｉｎ、２ｕｇ／ｍｌ

Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ｌｍｍｏｌ／Ｉ．ＰＭＳＦ）裂解细胞，冰卜孵育

１５ｍｉｎ。将裂解物进行离心１２０００ｒ／ｒａｉｎ，离心半径７ｃｍ，４℃，１０ｒａｉｎ，将卜－清分离到Ｉ．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ

管中。用ＢＣＡ法测定蛋白浓度，最后制备电泳样

品，一２０℃冻存。１．２．６Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ：取细胞总蛋白电泳样品（０【一ＳＭＡ：总蛋白１斗ｇ，１０％ＳＤＳＰＡＧＥ；ＲｈｏＡ：总蛋白１０ｕｇ，１２％ＳＤＳＰＡＧＥ）ＳＤＳＰＡＧＥ。再将凝胶上

的蛋白用半干法电转至ＰＶＤＦ膜上，５％脱脂奶粉４℃封闭过夜，分别选用０【一ＳＭＡ一抗１：３０００，Ｂ．

ａｃｔｉｎ一抗１：４０００；用ＴＢＳＴ洗３次，每次１０

ｍｉｎ。

山羊抗鼠二抗ｌ：１００００，各室温孵育ｌｈ，用ＴＢＳＴ

洗３次，每次１０ｒａｉｎ。洗涤后的膜用ＷｅｓｔｅｒｎＥＣＬ

发光剂室温下反应５ｍｉｎ，最后暗室曝光成像。

１．２．７统计学方法：用软件ＩｍａｇｅＪ１．４２分析数据，统计表达差异，得出结论。使用ＡＮＯＶＡ进行统汁学分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２结果２．１不同时问ＴＧＦ—Ｂ，对人皮肤成纤维细胞表型转化的影响１０ｎｇ／ｍｌ