不同取代羧甲基壳聚糖的制备及其结构测定*陈浩凡 潘仕荣 王琴梅中山大学附属第一医院人工心脏研究室,广州　510089 摘要　目的　制备不同取代的羧甲基壳聚糖并测定其结构。

方法　通过不同反应条件得到不同位置取代和取代度的羧甲基壳聚糖,并用物理和化学方法进行分子结构表征。

结果　在O 位和(或)N 位发生了羧甲基化反应,产物为不同取代度的N ,O-羧甲基壳聚糖(N ,O -CM C),N -羧甲基壳聚糖(N -CM C)和O-羧甲基壳聚糖(O-CM C)。

结论　胶体滴定法是测定羧甲基壳聚糖取代度的优选方法;壳聚糖羧甲基化后水溶性极大地改善,应用前景广泛。

关键词　羧甲基壳聚糖;　取代度;　电位滴定法;　胶体滴定法中图法分类号　R318.08S ynthesis of Carboxymethyl Chitosan and Determination of Substitution DegreeChen Haofan ,Pan Shirong ,Wang Qinm eiT he First H osp ital Af f iliated to Sun Yat -sen University of M ed ical Sciences ,Guangz hou 510089Abstract Objective T o prepare and determine carbox ymethyl chitosan w ith different substitution .Methods A series of carboxy methy l chitosan having various degrees and positions of substitution w ere ob-tained by controlling reaction conditions,and characterized by chemical and physical methods.Results Car-boxy methylation occurred at hydrox yl groups and (or)amino group.The products of N,O-carbox ymethyl chi-tosan (N ,O -CM C )with different degree of substitution ,N -carboxym ethyl (N -CMC )and O -carboxym ethyl (O-CM C)were obtained.Conclusion Colloid titration is the optimized method to determine substitution de-gree of carboxym ethyl chitosan.T he product has superior w ater-soluble property and broad prospect of applica-tion .Key words carboxym ethy l chitosan ;　substitution degree ;　electrolytic titration ;　colloid titration*　广东省自然科学基金资助项目(No .20001398)和广东省科技攻关项目(N o.K B02902G )陈浩凡,男,1972年生,博士研究生 甲壳素(chitin )大量存在于甲壳动物(如蟹、虾)的甲壳中,是地球上数量最多的含氮有机物。

由于甲壳素不溶于普通溶剂,故难以应用。

壳聚糖(chitosan)是甲壳素的N-脱乙酰基产物,能溶于酸性溶液,与人体细胞有很强的亲和性和相容性,并具有良好的吸湿性、纺丝性和成膜性,且无毒副作用,因而成为优良的生物医学材料。

羧甲基壳聚糖(carbox ymethyl chitosan ,CM C )是壳聚糖羧甲基化后的产物,由于它既保留了壳聚糖的优点,又极大地改善了水溶性,因而具有更广泛的用途,在众多甲壳素衍生物中,倍受关注。

取代度是壳聚糖在生产、研究和应用中一个重要的技术指标。

壳聚糖分子C 2氨基上的氢原子、C 3和C 6羟基上的氢原子均可以被羧甲基取代,但以医用材料为标准,研究不同取代位置、取代度羧甲基壳聚糖的制备,并对其结构进行测定,目前尚缺少系统报道。

本实验以甲壳素和壳聚糖为原料,合成N ,O -羧甲基壳聚糖(N ,O-CMC),N-羧甲基壳聚糖(N-CMC)和O-羧甲基壳聚糖(O-CMC),通过物理和化学方法,测定不同取代羧甲基壳聚糖的分子量、取代位置、取代度及其结构特征,为研究其结构与防止手术后粘连作用之间的构效关系奠定基础并提供有关技术参数。

1　材料和方法1.1　材料和仪器甲壳素和壳聚糖(脱乙酰度87%,江苏南通双林生物制品有限公司);乙醛酸(德国Merk -第32卷第2期第152页2003年4月华中科技大学学报(医学版)J Huazhong U niv Sci T ech [Heal th Sci]Vol.32　No.2　P.152Apr.2003Schuchardt公司);硼氢化钠(NaBH4,常州新华活性材料研究所);聚乙烯醇硫酸钾(PVSK,天津轻工业学院提供);聚二丙烯二甲基氯化铵(PDM-DAAC,上海恒谊化工有限公司);甲苯胺蓝(T B,日本和光纯药工业株式会社);盐酸和氢氧化钠为分析纯,其它试剂为化学纯。

红外光谱仪(EQUINOX型,德国Bruker公司);核磁共振谱仪(INOVA-500型,美国Varian公司);元素分析仪(Vario EL型,德国Elementar公司)。

定时恒温磁力搅拌器JB-3型,酸度计PHS-3C 型(上海虹益仪器厂),20ml碱式滴定管,50m l酸式滴定管;5ml微量滴定管,乌氏粘度计。

1.2　制备1.2.1　N-羧甲基壳聚糖(N-CMC):称取1g壳聚糖于500ml锥形瓶中,加蒸馏水150ml,搅拌均匀,按摩尔比(壳聚糖∶乙醛酸)1∶1.2加入乙醛酸,反应1.5h,测得pH值为3.6左右。

用10%NaOH调pH值8～9,再分次滴加10%NaBH4溶液5ml,再反应2h。

反应毕,用稀盐酸调至中性,用95%乙醇充分沉淀,过滤,无水乙醇及丙酮反复冲洗,干燥得到白色粉末状固体[2,3]。

1.2.2　N,O-羧甲基壳聚糖(N,O-CM C):通过不同的反应时间、温度、投料比和碱的浓度(表1)来控制取代度。

称取粉末状壳聚糖(脱乙酰度为87.29%)于锥形瓶中,加入一定浓度NaOH溶液,搅拌均匀,常温下碱化2h。

将氯乙酸溶于异丙醇中,分数次,间隔5min加入,再水浴加热反应一定时间。

反应毕冷却,倾去上层清液,下层粘状物中加入适量水,充分搅拌溶解,用10%盐酸调至中性。

滤去不溶物,滤液中加入适量95%乙醇充分沉淀,过滤,无水乙醇反复冲洗,固体置真空烘箱中60℃烘干备用[4]。

表1　N,O-羧甲基壳聚糖的制备条件样品编号投料比(氯乙酸∶壳聚糖)N aOH的浓度(%)反应温度(℃)反应时间(h)1630708254070436405064550508545050 4.51.2.3　O-羧甲基壳聚糖(O-CMC):称取甲壳素5 g,置于250ml锥形瓶中,加入50%NaOH溶液适量,少量相转移催化剂十二烷基苯磺酸钠,在-18℃冰箱中碱化1～2d,滤去NaOH,加入氯乙酸22g,异丙醇80ml,少量NaBH4。

室温搅拌3h,再60℃恒温水浴3h,过滤,沉淀用80%乙醇洗涤,再用95%乙醇反复冲洗,除去未反应的氯乙酸,干燥后得O-羧甲基甲壳素。

于三颈烧瓶中加入上述O-羧甲基甲壳素,60%NaOH溶液90ml,装上温度计,回流冷凝管,80℃下反应0.5h,然后温度升至120℃反应1.5～2h。

反应毕冷却,倾去上层清液,粘状物中加入适量水,充分搅拌溶解,过滤,滤液用乙酸调至中性,用95%酒精沉淀,过滤。

用无水乙醇及丙酮洗涤2～3次,干燥得到白色纤维状固体。

1.3　结构测定羧甲基壳聚糖粘均分子量(M )用粘度法测定[1,5],用0.1mol/L乙酸/0.2mol/L NaCl为溶剂,在25℃下,用乌氏粘度计采用逐步稀释法测定特性粘数[ ],所用M ark-Houw ink方程为:[ ]= 1.424×10-3M 0.96。

羧甲基壳聚糖的红外光谱和核磁共振谱(1H NM R)由中山大学测试中心完成。

1.4　羧甲基壳聚糖取代度及取代位置1.4.1　电位滴定[2,6]:准确称取产品0.2g试样,溶于一定量的0.3mol/L HCl标准溶液中,再加水配成50ml的溶液,精确量取20ml于锥形瓶中,用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定,用PHS-3C型pH 计测定,记录NaOH标准溶液体积(ml)与pH值对应关系,可得电位滴定曲线,用二阶微商法确定突跃点。

1.4.2　胶体滴定[7]:PVSK和PDM DAAC均配成浓度为1mmol/L标准溶液。

—NH3+可用标准聚阴离子PVSK直接滴定,聚—COO-则用间接法测定,即先加入过量的标准聚阳离子PDM DAAC,再用PVSK反滴定过量的PDM DAAC。

样品于真空烘箱中80℃干燥至恒重,精确称取一定重量的样品(g),以蒸馏水溶解,25ml容量瓶定容,配制成约0.02%的稀溶液。

羧甲基壳聚糖氨基含量(—NH2%)的测定:准确移取上述稀溶液5ml于锥形瓶中,加入0.2 m ol/L的HCl溶液2m l和TB指示剂1滴,摇匀后用PVSK标准溶液滴定至溶液由蓝色变为亮紫色(10s内不返色),记下消耗的PVSK标准溶液的体积V a;另移取5ml蒸馏水做空白实验,得到空白值V a0。

羧甲基壳聚糖羧基含量(—COOH%)的测定:准确移取上述稀溶液2m l于锥形瓶中,加0.1 m ol/L的NaOH溶液1ml、PDM DAAC标准溶液5 m l和TB指示剂1滴,摇匀后用PVSK标准溶液滴定至溶液由蓝色变为亮紫色(10s内不返色),记下消耗的PVSK标准溶液的体积V b(m l);另做一空白・153・陈浩凡等.不同取代羧甲基壳聚糖的制备及其结构测定实验,得到空白值为V b0(ml)。

以上均滴定3次取平均值。

按下列公式分别计算羧甲基壳聚糖的氨基含量(—NH2%)和羧基含量(—COOH%)即总取代度(DS),N位和O位的取代度。

NH2%=M CM CG×5/25C PVSK(V a-V a0)+58×100%COOH%=M CH I TOSAN-42DDG×2/25C PVS K(V b-V b0)-58×100%DS N=DD-N H2%DS O=DS-DS N式中:C PVS K——PVSK标准溶液浓度(mmol/L);G ——样品克数(g);M CM C——羧甲基壳聚糖的链节分子量219.19;M CH I TOSA N——壳聚糖的链节分子量161.15;58——羧甲基分子量;DD——脱乙酰度;DS N——N位取代度;DS O——O位取代度; DS——羧基含量(-COOH%)即总取代度。