摘要: 采用 K rom a sil C 18 色谱柱 ( 5 Λ m 粒径, 200×4. 6 mm 内径) , 流动相为乙腈- 10 mm o l L 乙酸铵溶液 (V ( 乙腈) ∶V ( 乙酸铵) = 60∶45) , 建立快速分析抗生素新药必特螺旋霉素中复杂多组分的分析方法。 采用电 喷雾离子化源, 以正离子检测方式进行一级、 二级全扫描质谱分析。 研究表明: 其中含有 10 种螺旋霉素类衍 生物并推断出化学结构, 通过与对照品的色谱和质谱行为对比得到验证。采用液相色谱2质谱联用技术 (L C 2 便捷的分 M Sn ) 可以快速阐明复杂多组分抗生素新药必特螺旋霉素类的化学组成, 并且可以作为一种简单、 析方法对大环内酯类新抗生素进行高通量筛选。 关键词: 质谱学; 必特螺旋霉素多组分测定; 液相色谱2质谱联用法 (L C 2 M Sn ) ; 大环内酯类抗生素 中图分类号: O 657. 63; R 917 文献标识码: A 文章编号: 100422997 ( 2003) 042460204
霉素乙腈溶液直接注入质谱仪, 获得必特螺旋霉 素的一级全扫描质谱图 ( 示于图 1 ) 。 在质谱图 中, 相对丰度比较高的的准分子离子峰 [M + + 969、 927、 955、 941、 899, 及一组 H ] 为 m z 983、 2+ 分别对应的双电荷离子峰 [M + 2H ] m z 492、 485、 464、 478、 471、 450。 必特螺旋霉素中各主要 成分在正离子检测方式下的一级全扫描色谱图 中有 10 个主要的色谱峰 ( 示于图 2) 。 其对应的 准分子离子峰 [M + H ] + 列于表 1, 分别做二级全 扫描质谱分析, 二级碎片离子见表 1。 其中峰 b 和峰 d、 峰 c 和峰 I 、 峰 e 和峰 f, 峰 g 和峰 h 分别 具有相同的准分子离子峰, 但二级质谱碎片不 同, 推测为四对同分异构体。 根据各自的二级全 扫描质谱碎片, 并与异戊酰螺旋霉素 的二级全 扫描质谱碎片离子对比, 可以推测 R 1 和 R 2 的异 同, 从而推断出各自的化学结构 ( 示于图 3 和列 于表 1) 。由此可见, 必特螺旋霉素为多种组分的 混合物。 螺旋霉素类衍生物的化学结构主要由四部 分 组 成: 内 酯 环 (M acro lide ) 、福 洛 氨 糖 (Fo ro sam ine ) 、 碳霉氨糖 (M ycam ino se ) 和碳霉 糖 (M yca ro se) , 其结构示于图 3。
Table 1 Com ponen ts in B itesp iram yc in
峰 ( Peak ) m z
a b c d 983 969 927 969
M S2 824, 755, 596 810, 741, 582 768, 699, 681 810, 755, 596
组分 (Com ponen ts) 异戊酰螺旋霉素 异戊酰螺旋霉素 异戊酰螺旋霉素
( ( Iso ) Bu tanoylsp iram ycin ( ( Iso ) Bu tanoylsp iram ycin ( P rop ionylsp iram ycin ( P rop ionylsp iram ycin (A cetylsp iram ycin (A cetylsp iram ycin ( Sp iram ycin ) ) ) ) )
图 1 必特螺旋霉素一级全扫描质谱图
F ig. 1 Full scan ma ss spectrum of B itesp iram yc in
图 2 必特螺旋霉素一级全扫描色谱图
F ig. 2 Full scan chroma togram of B itesp iram yc in
图 3 螺旋霉素类衍生物化学结构式示意图
第 24 卷 第 4 期
2003 年 10 月
质谱学报
Jou rna l of Ch inese M a ss Sp ectrom etry Society
. 24 N o. 4 Vol O ct. 2003
液相色谱- 质谱联用法鉴定必特螺旋霉素中多组分
史向国, 钟大放
( 沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室, 辽宁 沈阳 110016)
收稿日期: 2003202224; 修回日期: 2003209215 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39930180) 作者简介: 史向国 (1974 ～ ) , 男 ( 汉族) , 吉林长春市人, 博士生, 药物代谢与药物动力学专业
E-ma il: sx iangguo@ 163. com 3 通讯作者: 钟大放, 教授, 博士生导师, 电话: (024) 23902539, E 2 m ail: Zhongdf@ ch ina. com
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第 4 期 史向国等, 液相色谱2质谱联用法鉴定必特螺旋霉素中多组分
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有限公司产品; 水为自制二次重蒸水。
2 实验方法
2. 1 液相色谱2质谱分析条件 色谱柱: K rom a sil C 18 柱 ( 5 Λ m 粒径, 200 × 4. 6 mm 内径) : 天津凯德科学仪器有限公司产 品; 流动相: 乙腈 - 10 mm o l L 乙酸铵溶液 ( V ( 乙腈) ∶V ( 乙酸铵溶液) = 60 ∶45 ) ; 质谱条件: ES I 源; 正 离 子 检 测; 鞘 气 (N 2 ) 流 速 0. 75 L m in; 辅助气 (N 2 ) 流速 0. 15 L m in; 源电压 4. 5 kV ; 毛细管温度 180 ℃; 毛细管电压 6 V ; 管透
4. 3 半定量
图 4 异戊酰螺旋霉素
二级全扫描质谱图
a t m z 983
F ig. 4 Product ion spectrum of [M + H ] + of Isova lerysp iram yc in
4 讨 论
4. 1 色谱条件
实验中曾尝试使用了市售多种品牌的 C 8 和
过已有的各组分对照品进行验证, 旨在证明液相 色谱2质谱联用法用于分析复杂大环内酯类抗生 素具有独特的优越性。
1 实验部分
1. 1 主要仪器 L CQ 型液相色谱2质谱联用仪: 美国 F inn i2 gan 公司产品, 配有 电 喷 雾 离 子 化 源 ( ES I) 及 L CQ 1. 2 数据处理系统, 具有软电离和多级离子
10 mm o l L ) , 分离效果越好, 10 mm o l L 是电喷
雾质谱仪常规使用时所能采用的最高浓度。 如调 节流动相至酸性, 则分离度降低; 如调节流动相 至碱性, 则分离度继续增加, 但会使色谱保留时 间过长, 并且在正离子检测方式下, 使灵敏度下 降, 故实验中未调节流动相的酸碱度。 4. 2 质谱条件 如果流动相或样品溶液中含有甲醇, 螺旋霉 素类衍生物在正离子检测方式下, 会出现甲醇加 合峰, 降低检测灵敏度及干扰待测物质的分析, 故分析系统中没有使用甲醇。 由于螺旋霉素类衍生物中含有两个氨基糖: 福洛氨糖和碳霉氨糖, 带有一定的碱性 (p K 1 = 7. 1, p K 2 = 8. 4) , 使其在质谱中具有较高的灵敏 度。 在一级全扫描质谱图中不仅可看到各组分的 准分子离子峰 [M + H ] + , 还可以看到大量对应 的双电荷离子峰 [M + 2H ] 2+ 。 对双电荷离子峰 做二级全扫描质谱分析, 与准分子离子峰二级全 扫描质谱分析结果对比, 有助于推断和验证各组 分的化学结构。

或 CO CH (CH 3 ) 2
CO CH 2CH 2CH 3
e f g h i j
955 955 941 941 927 899
796, 741, 582 796, 755, 596 782, 741, 582 782, 755, 596 768, 741, 582 755, 740, 596
( 异) 丁酰螺旋霉素
)
CO CH 3 CO CH 2CH 3 CO CH 3 CO CH 2CH 3 CO CH 3 CO H 2CH 3
或 CO CH (CH 3 ) 2
CO CH 2CH 3 CO CH 2CH 3 CO CH 3 CO CH 3 H
丙酰螺旋霉素 丙酰螺旋霉素 乙酰螺旋霉素 乙酰螺旋霉素 螺旋霉素
根据推断的化学结构, 与各自对应的对照品 的色谱和质谱行为对比, 验证推断结果的准确 性: 采用液相色谱质谱联用法分析各组分对照品 的乙腈溶液, 发现组分 a 2j 分别与各自对应对照 品的一、 二级质谱、 色谱行为相同。
F ig. 3 Geom etr ic structure prof ile of Sp iram yc in der iva tives
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质 谱 学 报 第 24 卷 表 1 必特螺旋霉素中各组分一览表
由中国医学科学院研制的必特螺旋霉素 ( 原 名生技霉素) , 属基因工程菌产生的螺旋霉素类 衍生物的混合物, 主要成分为异戊酰螺旋霉素 , , [ 1 ] , 是处于临床研究阶段的抗生素新 药。 为阐明复杂混合物中主要成分的化学结构, 传统的成分鉴定方法为通过正相和反相色谱分 离得到每个化合物的单体, 再进行结构解析, 其 中有些分离鉴定出来的单体为已知化合物, 此过 程耗费大量的时间、 人力和物力[ 2 ]。液相色谱2质 n 谱联用法 (L C 2 M S ) 集液相色谱的高分离能力与 质谱的高灵敏度和高专属性于一体, 已成为包括 药物微量杂质的分析鉴定[ 3 ]、 药物降解产物的分 [4] 析鉴定 、 体内药物及代谢产物的药物动力学研 究等在内的现代药学研究领域最强有力的分析 n 工具之一[ 5 ]。 采用 L C 2 M S 对微生物发酵产生的 多组分混合物进行化学筛选, 一次或少数几次即 可全面地获得整个发酵产物的化学组成、 含量及 结构等信息, 在研究的早期即鉴别或鉴定出化合 物的结构及预测出新化合物的存在[ 6 ]。 n 本实验拟采用 L C 2 M S 快速鉴定大环内酯 类抗生素新药必特螺旋霉素中 10 种组分, 并通