氧化损伤致细胞凋亡相关基因的检测
Bcl-2基因的检测： Bcl-2的过度表达能阻抑多种凋亡相关基因的表达, 如caspase23 的表达。测定方法主要有印迹杂交和实时荧光定量法。 p53基因的检测；是细胞生长周期中负调节因子，氧化应激导致细胞 DNA损伤的过程必须有p53参与。常采用免疫组织化学、原位杂交等方 法来检测。
氧化应激导致细胞凋亡的检测方法
氧化应激导致细胞凋亡的形态学检测 主要通过光镜伊红染色或吉 姆萨染色和电镜对凋亡的细胞进行形态观察,可观察到染色质浓缩, 核膜起皱破裂,凋亡小体形成等,以判别细胞凋亡。
磷脂酰丝氨酸外翻分析 ROS致细胞凋亡的早期改变之一是细胞膜 磷脂酰丝氨酸从细胞膜内转向细胞膜外。膜粘连蛋白5对转向到细胞 膜外的细胞膜磷脂酰丝氨酸有高度的亲和性。用异硫氰酸荧光素标 记膜粘连蛋白5,结合使用碘化丙啶对凋亡细胞进行双染色,即可区别 凋亡细胞与坏死细胞。
262.00±5.90
雌
255.33±8.48
256.67±20.27
259.00±10.66
雄
332.50±14.67
305.67±4.46
294.83±14.20
雌
260.00±6.87
252.00±5.33
255.67±14.62
雄
355.00±13.63a
321.00±6.95b
340.83±14.16b
肠粘膜屏障构成
机械屏障 化学屏障 生物屏障 免疫屏障
机械屏障 机械屏障主要由紧密连
接的粘膜上皮细胞以及鞘 液凝胶层组成。
化学屏障 主要是胃酸、胆汁酸、粘液、溶菌酶、乳铁蛋白和各种消化酶
等对阻止致病因子入侵，维护肠粘膜屏障具有重要作用。
生物屏障 在生理状态下机体的肠
道存在大量共生细菌，它们 通过分泌细菌毒素、产生短 链脂肪酸、促进肠蠕动、占 据致病菌粘附位点以及争夺 营养素等多个环节防止有害 细菌的侵入，维护动物体健 康。而保持菌群间合适的数 量与比例，对于维护肠粘膜
位)
对照组 34.40±24.38a
4.51±0.29a 80.71±2.93a 449.90±6.31a
诱导组 30.57±10.11b 5.07±0.10b 67.05±4.60b 393.15±6.58b
修复组 40.19±10.89b
2.57±0.10c 93.91±1.64a 530.90±17.43bc
0 serum SOD activity (U/ml)
安静对照组 游泳对照组 VC组 VE组 茶多酚组 微生物组 复合抗组
不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中SOD活性的影响
韩雪，2010
6 5 4 3 2 1 0
serum MDA concentration(nmol/ml)
安静对照组 游泳对照组 VC组 VE组 茶多酚组 TP组 复合抗组
操作简单,价格低廉,目前被广泛用于ROS的检测和研究。
间接 测定法
脂质过氧化损伤的测定
测定丙二醛的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间 接反映出细胞损伤的程度。常用硫代巴比妥酸法来测定 丙二醛含量,此法是应用最多也是最古老的方法。
DNA氧化损伤的检测
DNA被氧化时,鸟苷酸的C-8是最易发生损伤的位点。因而,由此 形成的8-羟基脱氧鸟苷是评价DNA氧化损伤最常使用的生物标 志物。 8-羟基脱氧鸟苷的特异性单克隆抗体，彗星实验又称单细胞凝 胶电泳。
不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中MDA含量的影响
韩雪，2010
CAT(U/mgprot)
70 60 50 40 30 20 10
0 肝脏CAT (U/mgprot)
安静对照组 游泳对照组 VC组 VE组 茶多酚组 微生物组 复合组
不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠肝脏中CAT活性的影响
韩雪，2010
项目 第1日体重 第7日体重 第15日体重 第22天体重 日增重 (g)
屏障的完整性至关重要。
免疫屏障 肠道相关淋巴组织包括
肠集合淋巴小节，固有膜淋 巴细胞和上皮内淋巴细胞， 是机体内最大的免疫器官， 在肠道执行局部免疫功能， 并与其它因素协同作用，维 护肠粘膜屏障功能。
二、氧化应激与消化道损伤
氧化应激产生自由基直接作用于细胞发挥作用。
主要有四种致细胞损伤机制：
1）对脂类和细胞膜的破坏,从而导致细胞死亡。 2）对蛋白质、酶的损伤,从而导致蛋白质变性,功能丧失和酶失活。 3）对核酸和染色体的破坏,从而导致DNA链的断裂,染色体的畸变 和断裂。 4）对细胞外基质的破坏,从而使细胞外基质变得疏松,弹性降低。
氧化应激与消化道功能的关系
汇报人：朱丽慧 上海交通大学
2010年10月17日
主要内容
1. 氧化损伤的机理 2. 氧化应激与消化道损伤 3. 抗氧化剂对氧化损伤的修复作用 4. 展望
神经紊 乱
肠炎
代谢疾 病
心血管 疾病
氧化 应激
急性炎 症
肠蠕动紊 乱
一、氧化损伤的机理
生物体在代谢过程中，产生许多自由基，这些自由基通 常不会导致组织细胞的损伤，机体依靠自身体内的抗氧 化防御体系，可以保护机体组织、细胞，防止自由基的 损伤。 当生物机体细胞内产生的自由基的水平高于细胞的抗氧 化防御能力时，氧化还原状态失衡，过量的自由基存在 于组织或细胞内，即诱发氧化应激，并导致氧化损伤。
在临床试验中发现给予自由基清除剂可以预防 难治性溃疡复发，促进其愈合。
流行病学调查揭示，抗氧化剂如维生素C和维 生素E的缺乏与胃癌发生有关。补充维生素C可 人减和少动胃物粘研膜究中中的发D现N，A损病害变。肠黏膜中ROS产 生明显增多，ROS同疾病活动性相关。
氧化损伤的检测方法
直接检测法
电子自旋共振法
蛋白质氧化损伤的检测
其传统的检测技术是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度 法或者酶联免疫吸附法测定2, 4-二硝基苯肼与蛋白质羰基反 应生成的腙,来衡量蛋白质的损伤情况。
抗氧化酶类的检测
超氧化物歧化酶的检测SOD
SOD能通过歧化作用清除氧自由基，测定SOD的活力可间接反 应组织细胞抗氧化损伤、机体清除自由基的能力。直接法和间 接法,包括电泳法、免疫法、ESR 法、化学发光法、脉冲辐解 法、紫外分光光度计法等。
DNA片断化检测
氧化应激致细胞凋亡时，其染色质发生浓缩,染色质DNA断裂,形成 50～300kb长的DNA大片段,或者180～200bp 整数倍的寡核苷酸片段, 健康活细胞DNA电泳为一条区带,而凋亡细胞DNA 电泳出现特征性的阶 梯状条带。有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。
应激24h细胞DNA琼脂糖电泳图 陈群，2007
氧化应激对消化道功能的影响
对消化道粘膜结构形态的损伤 肠粘膜中的细胞膜过脂质氧化，损伤肠粘膜组织，
肠粘液层变薄、绒毛变短、绒毛表面积减少、隐窝变浅， 过氧化物和自由基刺激肠道腺体分泌，引起肠炎的发生， 而腹泻又加剧了肠道粘膜组织的损伤程度。
对消化道屏障和吸收功能的影响
当肠道内氧自由基增加时，会使肠道中耐受能力较弱的乳 酸菌数量减少，大肠杆菌的数量上升。
正常大鼠肠结构
静脉注射LPS后肠道病理变化 马可，2006
对照组诱导组修Fra bibliotek组对照组、LPS诱导组和复合抗氧化剂修复组空肠光镜照片(×4)
赵珂立，待发表
胃溃疡 慢性胃炎 消化性溃疡 胃癌 结肠疾病
自由基与胃肠道疾病
与自由基有关，其中主要与NO及O2-有关，氧自 由基能直接作用于细胞的大分子，同时可作为细胞 氧 炎 基 内 k急 生B自 的 有 信 性 物)激由 主 关 息 、 学活基 要 。 转 慢 基，学 因 导 性 础引说 素 信 炎 。起认 之 号 症核为 一 引 及内： ， 起 免有幽 而 细 疫关门 其 胞 失的螺 诱 浆 调基旋发内等因杆机核疾转菌制转病录可录发(H增能因生p加)同子发致。氧展(慢如是自的性N很由分F胃多-子
雌
2.48±0.23
2.15±0.03
2.35±0.70
雄
6.15±0.14b
5.48±0.18a
5.70±0.44a
赵珂立，2010未发表
复合抗氧化剂对LPS损伤大鼠肝脏脏器系数、 MDA含量、SOD和GSH-Px活力的影响
项目
肝脏指数(mg/g)
MDA(nmol/ml) SOD(U/ml) GSH-Px(酶活力单
• 提高抗氧化酶活性，降低膜的流动性，从而降低自由基反应， 达到抑制脂质过氧化作用。
酶类抗氧化剂
• 超氧化物歧化酶(SOD) • 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) • 过氧化氢酶(CAT)
非酶类抗氧化剂
• VE •硒 • VC
新型天然抗氧化剂
• 茶多酚 • 类黄酮 • 中草药 • 微生物源性抗氧化剂
氧化损伤
DNA氧化损伤 碱基损伤 DNA链的断裂
蛋白质过氧化 受体和酶
细胞膜脂质过氧化 磷脂过氧化
辐射
高
高
温
氧
应
激
· NO·
自由基
脂质、蛋白质和DNA的氧化会对生物体造成不同程度的危害， 从而影响机体的生长、发育、衰老等过程。急性和慢性的应激 都能通过产生自由基诱导胃肠道的氧化应激。
其中对消化道的氧化损伤在动物生产中发生率最高、隐蔽性强、 危害性大。过量的自由基极易诱发消化道疾病，给畜牧业的发 展造成巨大损失。
核因子kB基因的检测（NF-kB）：在正常情况下是复合物，氧化应激状 态下,NF-kB从复合体中解离并向核内移动,与位于核内的基因序列上特 异性调控区结合,从而激活受调控的基因表达。免疫化学染色法、聚丙 烯酰胺凝胶电泳法、原位杂交法。
三、抗氧化剂对氧化损伤的修复作用
抗氧化物质主要的作用机制：
• 通过提供活性基团，作为供氢体与自由基反应，使之形成相应 的离子或分子，灭活自由基，终止自由基的链式反应；