中国生物工程杂志󰀁ChinaBiotechnology,2008,28(4):93~97

巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展

牟󰀁琳1󰀁王红宁2*󰀁邹立扣1

(1四川农业大学生命科学学院󰀁雅安󰀁625014)(2四川大学生命科学学院动物疾病防控生物工程研究中心󰀁成都󰀁610064)

摘要󰀁巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的分泌型基因工程宿主菌,现已广泛应用于工业和学术研

究领域,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。综述了其自身的优点、

表达载体的特点、巨大芽孢杆菌的转化方法、外源蛋白的表达、高效表达的策略以及表达系统的

应用。

关键词󰀁巨大芽孢杆菌󰀁外源蛋白󰀁高效表达

中图分类号󰀁Q789

收稿日期:2007󰀁11󰀁24󰀁󰀁修回日期:2007󰀁12󰀁27*国家󰀂十五 重点科技攻关资助项目(2002BA514A󰀁12)**通讯作者,电子信箱:whongning@163.com󰀁󰀁巨大芽孢杆菌表达系统是一种很好的表达外源基

因的系统。由于其分布广泛,生化功能多样,以及能表

达、分泌、加工外源蛋白而不降解外源蛋白,巨大芽孢

杆菌越来越多地作为表达外源基因的宿主菌,在工业

以及学术研究领域得到了广泛的应用。

1󰀁巨大芽孢杆菌概述

󰀁󰀁巨大芽孢杆菌体型巨大,超过60󰀁m3(2.5!2.5!

10),是大肠杆菌体积的100倍以上[1]。其能依靠多种

碳源生长,因而分布十分广泛。同时,巨大芽孢杆菌能

降解一些顽固的难降解的杀虫剂[2,3],因此对环境具有十分重要的作用。󰀁󰀁一些巨大芽孢杆菌的蛋白质具有重要的作用。例

如:其细胞色素P󰀁450单加氧酶系同真核细胞色素P󰀁

450单加氧酶系相似,在许多疾病中发挥着类似的作

用。另外,在工业上,巨大芽孢杆菌分泌的酶应用也十

分广泛,如淀粉酶应用于面包生产、青霉素酰胺酶应用

于合成新型人工抗生素等。很多基因在该菌中都得到

了较好的表达及分泌。

2󰀁巨大芽孢杆菌在表达外源蛋白中的优点

2.1󰀁能利用多种碳源󰀁󰀁巨大芽孢杆菌能利用多种碳源,营养要求低,生长快。在许多生态环境中都存在着巨大芽孢杆菌,例如

肉类加工厂的废弃物中,石化产品的排出物中都有巨

大芽孢杆菌,另外,巨大芽孢杆菌在28~37∀都能很好

地生长,它的这些特点能有效降低培养成本,便于工业

化生产。

2.2󰀁蛋白质表达产量高,稳定性好󰀁󰀁与其它芽孢杆菌相比,巨大芽孢杆菌不具有碱性

蛋白酶,表达的外源蛋白不会被降解,重组质粒稳定,

不易丢失[4]。此外,巨大芽孢杆菌细胞壁的组成简单,

只含有肽聚糖和磷壁质,因此在分泌的蛋白质产品中

不会混杂有内毒素(热源性脂多糖),因此外源蛋白产

量大,适用于工业大规模的蛋白质生产。

2.3󰀁分泌量大且分泌的蛋白易纯化󰀁󰀁在巨大芽孢杆菌中表达的蛋白既可以存在于胞

内,又可以存在于胞外。由于其只有一层细胞膜,因而

可以大量分泌蛋白至培养基中,蛋白跨越细胞膜后,被

加工和直接释放到培养基中以活性结构生成而不发生

聚集,避免了复性的困难[5]。产物与大量的细胞蛋白

分离,回收和纯化蛋白较为简单。

2.4󰀁良好的发酵基础和生产技术󰀁󰀁巨大芽孢杆菌发酵工艺和产物回收技术较成熟,

用作外源蛋白的分泌型宿主菌,具有很大的潜力。巨

大芽孢杆菌在工业上被用于生产蛋白酶、󰀂󰀁淀粉酶等。

在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。细胞的

生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究。中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo.l28No.42008

3󰀁巨大芽孢杆菌表达载体

󰀁󰀁表达载体包括启动子、外源基因克隆位点、分泌信

号、终止子、筛选标记、复制起点、信号肽序列等。为了

便于操作,用于转化适合巨大芽孢杆菌宿主细胞的表

达载体均为大肠杆菌和巨大芽孢杆菌的󰀂穿梭 质

粒[6],先在大肠杆菌中复制扩增,然后被导入巨大芽孢

杆菌宿主细胞。它是由来自巨大芽孢杆菌的部分基因

序列和大肠杆菌的部分基因序列所组成。其大肠杆菌

部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起始序列(ori)

和特定的抗性基因序列。这两部分主要是作为在大肠

杆菌宿主中的增殖和筛选组分。巨大芽孢杆菌部分包

括:巨大芽孢杆菌转化子的筛选组分以及编码特定蛋

白的基因启动子和终止子序列。后两者之间为多克隆

位点。󰀁󰀁现在使用得比较普遍的载体是pHIS1522和

pHIS1525,它们都来源于Rygus和Hillen的pWH1520

载体[7,8],是由芽孢杆菌质粒pBC16和大肠杆菌质粒

pBR322两者构成的穿梭质粒。下面将简述载体

pHIS1522和PHIS1525的特点。

3.1󰀁木糖启动子󰀁󰀁1991年,Rygus与Hillen发现了位于巨大芽孢杆菌

基因组上的木糖诱导的启动子PxylA。在木糖存在情

况下,木糖异构酶基因xylA在PxylA控制下的表达比

木糖不存在时提高了200倍[9]。在重组质粒上采用木

糖启动子,在木糖存在情况下,目的基因在巨大芽孢杆

菌中的表达比加入木糖之前能提高130~350倍[10]。󰀁󰀁利用木糖启动子诱导基因表达的机理是:在木糖

存在的条件下,木糖阻遏子会从启动子上释放出来从

而使转录开始。这使外源蛋白在巨大芽孢杆菌中的表

达得到了很好的调控[10]。目前,木糖启动子系统已被

成功地用于许多异源原核及真核蛋白在巨大芽孢杆菌

中的胞内或胞外表达[9,11~15]。

3.2󰀁多克隆位点和组氨酸标签󰀁󰀁在木糖启动子的下游,具有多克隆位点,包括

BamHI、SacI、KpnI等共15种限制性内切酶的酶切位

点,方便目的基因的插入。载体pHIS1522和pHIS1525

的多克隆位点有所不同。多克隆位点下游具有组氨酸

标签,能编码连续的6个组氨酸,易于目的蛋白的纯化

和探测。

3.3󰀁抗性基因󰀁󰀁载体pHIS1522和PHIS1525分别具有两种抗性基因:氨苄抗性基因和四环素抗性基因。其中,氨苄抗性

基因属于大肠杆菌中的筛选组分,四环素抗性基因则

属于巨大芽孢杆菌中的筛选组分。这种载体存在的一

个弊端就是抗性基因的释放会产生耐药性菌株,存在

着安全隐患,这也是许多基因工程所用载体共有的一

个弊端。近年来相关研究者也提出了一些提高标记基

因安全性的策略:利用无争议的生物安全标记基因,例

如绿色荧光蛋白基因等;利用无选择标记基因的转化

系统等。

4󰀁巨大芽孢杆菌的转化

󰀁󰀁巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,其转化方法与大

肠杆菌等革兰氏阴性菌不同,一般有原生质体转化法

和电击转化法。

4.1󰀁原生质体转化法[16]

󰀁󰀁巨大芽孢杆菌的原生质体转化法是由PEG󰀁6000

介导的。首先需要溶菌酶的作用将巨大芽孢杆菌处理

为原生质体,继而将构建好的携带外源基因的质粒转

化进巨大芽孢杆菌中。当质粒进入巨大芽孢杆菌原生

质体中后,需要再生培养基使其形态功能恢复,同时需

要筛选培养基对转化子进行筛选。因此原生质体转化

法比较复杂。

4.2󰀁电击转化法󰀁󰀁对于革兰氏阳性菌巨大芽孢杆菌来说,电击转化

法是最简单快速且转化效率高的一种转化方法。电击

转化芽孢杆菌虽没有像大肠杆菌一样的转化效率,但

此方法能有效地将DNA引入巨大芽孢杆菌中。󰀁󰀁Alejandro等[17]用电击转化短芽孢杆菌时,发现在

电压6000V到15000V的条件下都能转化成功,随着

电压的提高,存活率从92%下降到58%,转化率从1.5!101上升到5.87!103转化子/󰀁gDNA。

5󰀁外源蛋白在巨大芽孢杆菌中的表达

5.1󰀁信号肽󰀁󰀁外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定

途径分泌至细胞外。几乎所有的分泌蛋白在合成时都

带有信号肽,信号肽在其分泌过程中发挥重要的作用:

(1)促进新生蛋白的折叠;(2)是转运元件识别和连接的

靶子;(3)与转运成分相互作用,介导蛋白多肽的转运。󰀁󰀁芽孢杆菌分泌蛋白的信号肽与大肠杆菌的一样,

也由N区(带正电荷),H区(8个以上疏水残基)和C

区(极性氨基酸)三部分组成。但前者信号肽的N区通942008,28(4)牟󰀁琳等:巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展

常比后者带有更多正电荷[18]。一般地,来自芽孢杆菌

的分泌蛋白能转运到大肠杆菌的周质腔中,而来自大

肠杆菌分泌蛋白的信号肽很少能在芽孢杆菌中起作

用[19]。这表明芽孢杆菌分泌元件对信号肽某一结构有

特殊的要求。鉴于此,芽孢杆菌表达外源基因的信号

肽主要来自芽孢杆菌本身和其他革兰氏阳性细菌的分

泌蛋白[20]。󰀁󰀁载体pHIS1525上有一段信号肽序列,其编码枯草

芽孢杆菌的一种胞外酯酶lipA,它能引导目的蛋白分

泌到细胞外。

5.2󰀁外源蛋白表达步骤󰀁󰀁外源蛋白在巨大芽孢杆菌中表达包含4个步骤:

(1)将编码外源蛋白的DNA序列克隆进含有巨大芽孢

杆菌启动子和转录终止序列的表达框中;(2)转化及在

宿主中稳定维持此DNA融合产物;(3)外源蛋白在特

定培养条件下合成;(4)外源蛋白的纯化及其与天然产

物的比较。一般而言,所使用的启动子必须是可调控

的,这样,可以在诱导前维持培养基以一种非表达模

式,从而降低了在生长阶段选择非表达突变细胞的机

会。这种不利选择通常会在外源蛋白高度表达给细胞

造成重负时,及外源蛋白表现毒性时发生。

6󰀁在巨大芽孢杆菌中高效表达外源蛋白的

策略

6.1󰀁选择合适的受体系统󰀁󰀁不同的表达载体具有不同的特异性启动子和终止

子,要使外源基因在巨大芽孢杆菌中得到高效表达必

需高效启动转录。Yang等[21]利用4种不同的巨大芽

孢杆菌宿主菌研究其对外源基因表达的影响,结果表

明,菌株YYBm1(不含胞外蛋白酶NprM,木糖利用缺陷

性)比菌株MS941(不含胞外蛋白酶NprM,但能利用木

糖)更有效表达目的基因。同时还利用木糖缺陷性菌

株WH323(含有胞外蛋白酶NprM,木糖利用缺陷性)提

高了异源基因的表达。因此,根据表达载体的特性选

择合适的巨大芽孢杆菌受体系统尤为重要。目前使用

较广泛的是巨大芽孢杆菌WH320。 󰀁半乳糖苷酶、葡

萄糖脱氢酶、变旋酶等都在WH320中得到了很高的

表达[10]。

6.2󰀁提高表达载体在细胞中的拷贝数󰀁󰀁外源基因在细胞中的拷贝数会影响相应mRNA的

拷贝数,对于非整合型质粒来说,增加表达载体在细胞中的拷贝数能提高外源基因转录的mRNA总量,从而可以提高外源蛋白的表达量。然而,并非所有高拷贝

的转化子都能产生高的表达量,特别在分泌表达时,这

可能是由于高水平表达阻断分泌途径所致。

6.3󰀁优化发酵条件󰀁󰀁采用不同的培养基配方,例如变换碳源、氮源,变

换培养基各成分的比例等;通过提高菌株的生物量来

提高外源蛋白表达量。影响巨大芽孢杆菌生长的外界

因素主要包括:(1)培养基组成。适当的培养基能使菌

株生长更好,大大增加了生物量,使表达量也相应大大

提高。(2)诱导前菌体OD值。巨大芽孢杆菌中蛋白

表达分2个阶段:一是生长阶段,在含甘油的培养基培

养菌体;二是诱导表达阶段,加入木糖到培养基中诱导

表达。一般来说,OD600值越高,生物量越大,则总的表

达量亦应该越高.但是OD600值越高培养基中氧和营养

供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性

都会对菌体产生影响。因此,高密度并不一定意味着

高表达。另外接种量、培养时间、诱导时间、培养温度、

诱导剂浓度、通气量、pH等发酵条件的优化对于提高

蛋白的表达量也是十分重要的。

7󰀁巨大芽孢杆菌表达系统的应用

󰀁󰀁近年来,巨大芽孢杆菌在表达外源基因方面得到

了广泛的研究,并展现出良好的前景。有越来越多的

外源蛋白在该系统中得到成功的表达。1989年,

Meinhardt等[22]将巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因重新克隆回巨大芽孢杆菌中,在没有选择压力的情况

下,经过3周的日常接种,依然保持稳定。1991年

Rygus等[10]报道了4种蛋白质编码基因在巨大芽孢杆

菌中的表达:来源于大肠杆菌的编码 󰀁半乳糖苷酶;来

源于巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶;来源于

Acinetobacter的变旋酶以及来源于人的类似尿激酶的

血浆酶原催化蛋白。在木糖操作子的调控下,这些基

因的表达提高130到350倍不等,且未发现蛋白酶水解

情况。1991年Rygus[9]报道了新陈代谢控制蛋白ccpA在巨大芽孢杆菌中的表达。2004年Malten[7,23]等将编

码葡聚糖蔗糖酶的基因在巨大芽孢杆菌中成功表达。

另外,在巨大芽孢杆菌中成功表达的外源蛋白还有来源于Lactobacillusreuteri的果聚糖蔗糖酶[24]、来源于

Thermobifidafusca的水解酶[25]等。󰀁󰀁本课题组在本实验室前期工作的基础上将来源于

枯草芽孢杆菌WHNB02的中性植酸酶基因去除信号

肽,与大肠杆菌#巨大芽孢杆菌穿梭载体pHIS1525连95