由于生物大分子中的生命金属离子 如Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)等,具有惰性气 体的电子结构。且在生物体内处在溶液状 态,不成晶体,没有适宜的光、磁信号,也不 可以用X射线技术研究成键状况和结构变 化。而过渡金属离子Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)等都 有不成对d电子,有光或磁信号可供研究。 如果将生物大分子中非过渡金属离子用具 有光、磁信息的过渡金属离子置换,用它 们与生物大分子的相互作用与行为来探察 非过渡金属离子的功能,这种技术称为 “离子探针技术”。所用的过渡金属离 子就叫“离子探针”。
6.1.2 分子探针
对于脱氧核糖核酸(DNA)片段检出、医学上的基 因诊断疾病、DNA片段碱基对序列分析和蛋白质的 分离检出等,由于碱基和蛋白质信号很弱,又无上述生 命金属,则须用信号较强的分子以共价键或氢键与生 物大分子连接并赋予生物大分子较强信号,以利于高 灵敏度检测。这种技术称为“分子探针技术”。所用 的有较强信号的分子称为“分子探针”。 例如：四甲基罗丹明、德克萨斯红、1-硝基-4-二 甲氨基苯并恶二唑、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、4,5二氨基荧光素等有机物都是较好的分子荧光探针(即 检测信号是分子荧光)。 有机分子探针按结合方式可分为嵌入、衍生、交 联和络合等。
离子探针 K(Ⅰ) Tl(Ⅰ) Zn(Ⅱ) Co(Ⅱ) Mg(Ⅱ) 离子半径(nm) 0.133 0.140 0.069 0.072 0.055 静电位(Z2/r) 0.75 0.67 4.80 4.88 5.12 离子探针 Mn(Ⅱ) Ca(Ⅱ) Gd(Ⅲ) Eu(Ⅲ) Tb(Ⅲ) 离子半径(nm) 0.088 0.099 0.0938 0.095 0.0923 静电位(Z2/r) 4.40 3.78
6.2.4穆兹堡尔谱探针
穆兹堡尔谱探针须采用穆兹堡尔谱仪测定。 它有三个重要参数：化学位移、四极超精细分 裂和兹曼(Zeeman)效应。 (1) 化学位移 它反映最邻近原子的电负性和成键的离子 特征。这和NMR、光电子能谱等的化学位移 的特征有类似之处。 (2) 四极超精细分裂 它主要反映了原子中电荷的分布,判断极性 的大小和方向。
第六章 生物分析中的探针
6.1 离子探针与分子探针概述 6.1.1 离子探针 生命过程是一个非常复杂的过程,研究生物大分子 结构与功能以及生物分子的转化是研究生命过程的一 个重要步骤。生物体中的许多酶和蛋白质就是含金属 离子的生物功能大分子。例如：羧肽酶含Zn、磷酸脂 酶含Mg、Cu和Zn、氨肽酶含Mg和Zn、钙蛋白酶含Ca、 铜蓝蛋白酶含Cu。研究表明,大多数酶都要靠金属离子 表现其活性,而且所有生物功能也都与金属离子有关。 这种金属离子称为“生命金属”。人们可以通过研究 这些生物体中的金属离子来研究生物分子的结构、性 能和功能。
6.2 离子探针基本类型 离子探针按其表达信息的特征可分为紫外可见光吸 收光谱探针、磁共振探针、荧光光谱探针、穆兹堡尔谱 探针。 6.2.1 紫外可见光吸收光谱探针 利用探针离子的d-d或f-f电子跃迁以及荷移跃迁吸)取代碳酸酐酶中的Zn(Ⅱ)后,由吸收光谱的变 化推断出该酶中的Zn(Ⅱ)结合部位是一个变形的四面体。 X射线分析也证实了这一点。 三价稀土离子是优良的Ca(Ⅱ)的吸收光谱探针,尤其 是Nd(Ⅲ),摩尔吸光系数最大,很灵敏。可以用其光谱研 究牛血清蛋白、谷氨酸合成酶、胰蛋白酶、铜蛋白超氧 化酶。之所以有较大的吸收系数是因为配位体较大的不 对称性造成的。
6.2.3荧光光谱探针
荧光光谱探针又可分为有机荧光探 针(即分子荧光探针)和离子荧光探针。探 针离子具有荧光特征,与生物大分子结合 后,其荧光特征,如：激发波长、发射波长、 荧光强度、荧光寿命、荧光量子产率、 各向异性等都会发生变化,从而获得生物 大分子的信息。目前用得最多的是稀土 离子深针。如[Ru(Phen)3(邻菲罗啉)]2+、 [Tb(EDTA)]-。
(2) 生物依据
探针离子置换原金属离子后,生物分子的基 本性质必须不产生变化,也就是说,置换后的生物 大分子的基本活性能被保留,还必须具有特征信 号以供检测,这就是生物依据。例如： a) Mn(Ⅱ)取代苹果酸酶中的Mg(Ⅱ)后,该酶同 样具有催化L－苹果酸脱羧的反应活性。 b) Co(Ⅱ)取代碳酸酐酶、羧肽酶、乳酸脱氢酶 中的Zn(Ⅱ),这些酶的活性分别为原来酶活性的 50%、160%和有活性。 c) Gd(Ⅲ)、Eu(Ⅲ)或Tb(Ⅲ)取代伴刀豆球蛋白 A中的Ca(Ⅱ),该蛋白仍然保持结合糖的的活性。
6.2.2磁共振探针
磁共振探针又可分为核磁共振探针和顺磁共振探 针两种。探针离子置换后,可进行NMR测定,根据化学位 移、偶合常数及与傅里叶变换、二维谱、NMR成象技 术的结合,着重研究1H、15N、31P的NMR谱,它是生物化 学的重要工具之一。用Tl(Ⅰ)取代生命金属K(Ⅰ),研究 205Tl的NMR,是了解K(Ⅰ)的生命功能的重要方法。兔 肌肉丙酮酸激活酶的生命作用就是用此方法进行研究 的。 顺磁共振可测定金属离子中未成对电子形成的磁 性质和磁参数。从而可获得原金属离子的共价键、配 体的性能、金属离子的氧化还原状态、立体化学结构 的信息。
6.1.3 离子探针的生物与化学依据
(1) 化学依据 从配位化学的概念出发,具有惰性气体的电子结构 的离子如Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)等,与大分子配体易 形成配合物。因此探针离子应与它们有相同或相似的 物理化学参数。如：离子电荷数、离子半径、化学配 位性质、立体化学行为。Mg(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和 Co(Ⅱ)、Ca(Ⅱ)和Gd(Ⅲ)、Eu(Ⅲ)、Tb(Ⅲ)各自的理化 参数相似,后者可分别做前者的离子探针。参数如下：
生命金属离子 易配位基团 K(Ⅰ) －O－、中性氧配位体 Mg(Ⅱ) 羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体 Ca(Ⅱ) 羧酸盐、磷酸盐、多齿状氧与氮配位体 Mn(Ⅱ) 羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体 Fe(Ⅱ) 氮配位体 Fe(Ⅲ) 羧酸基、酪氨酸、卟啉 Cu(Ⅱ) 胺类、硫配体 Cu(Ⅰ) 氮配位体 Zn(Ⅱ) 咪唑、半胱氨酸 Cd(Ⅱ) 半胱氨酸、巯基