聚酰胺树脂分离纯化神香草提取液工艺研究目的考察聚酰胺树脂分离纯化神香草提取液的最佳工艺条件。
方法以总黄酮和迷迭香酸为检测指标，采用单因素考察法筛选树脂纯化工艺中的最大上样量、水洗脱体积、洗脱剂用量、上样液浓度、树脂吸附时间、上样液pH值和洗脱速率等参数。
结果最佳纯化工艺参数为：神香草提取液浓度为10 mg/mL，最大上样量为12 mL，水洗脱2 BV去除杂质，40%乙醇洗脱9 BV，上样液迷迭香酸浓度86.3 μg/mL、总黄酮浓度117.8 μg/mL左右，树脂吸附时间为14 h，上样液pH值调至6.5，洗脱速度3.0 BV/h。
结论该方法简便易行，分离效果良好，适用于神香草提取液的分离纯化。
Abstract：Objective To investigate the optimal process conditions for the separation and purification of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss. by polyamide resins. Methods The total flavonoids and rosmarinic acid were used as the indexes. The maximum amount of sample solution，elution volume，concentration of sample solution，adsorption time of resin，loading time of sample solution and the amount of eluting solvent，pH and elution rate in the resin purification process were screened by single factor method. Results The optimal purification parameters were as follows：10 mg/mL of extract，12 mL of sample amount， 2 BV of water to remove impurities，40% ethanol to elute 9 BV；the concentration of rosmarinic acid in sample solution was 86.3 μg/mL，and the total flavonoid concentration was 117.8 μg/mL；the resin adsorption time was 14 h；the pH of sample solution was 6.5；the elution rate was 3.0 BV/h. Conclusion This method is simple and feasible，fit for separating and purifying of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss.Key words：Hyssopus cuspidatus Boriss.；polyamide resins；total flavonoid；rosmarinic acid；purification process神香草為唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss.的干燥地上部分，维吾尔名为“祖发奇尼”，是维吾尔族民间习用药材[1]，性质干热，有很强的香味，具有镇咳、袪痰、平喘作用，作为维吾尔医和民间用药已有几百年历史，疗效显著。
以神香草为主药的寒喘祖帕颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》1999年版，在新疆维吾尔医院临床用于治疗哮喘具有很好的疗效。
神香草含有黄酮类、多糖及苷、酚酸类、甾醇类、萜类化合物以及醛类、脂类、有机酸[2-4]等。
近年来，随着分离纯化技术的进步，对神香草的化学成分有了新的认识。
赵军等[5]报道，神香草中含有大量黄酮类化合物，具有抗炎、抗过敏及抑制细菌的作用。
迷迭香酸是神香草药材中质量分数较高的成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血栓和抑制透明质酸酶等多种生物活性[6]。
本课题前期神香草抗哮喘有效部位谱效学实验显示，神香草具有很好的抗哮喘作用，且初步确定了其活性有效部位[7]。
目前尚未见采用聚酰胺吸附树脂处理、纯化神香草抗哮喘有效部位的报道。
因此，本试验以迷迭香酸和總黄酮含量为指标，研究神香草抗哮喘有效部位的聚酰胺分离纯化工艺，优选最佳工艺参数，为神香草抗哮喘有效部位纯化的中试和工业化大生产提供可靠依据，也为神香草的制剂研究奠定基础。
1 仪器与试药UltiMate 3000系列高效液相色谱仪（包括二极管阵列检测器、四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、4～40 ℃恒温箱），美国Thermo Scientific Technologies公司；UV-2501PC型紫外分光光度计，日本岛津；DT500A 型电子计数天平，常熟市金羊砝码仪器有限公司金羊天平仪器厂；DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；BP211D型电子天平，德国Sartorius；RE-2000A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。
迷迭香酸对照品（批号111871-201203，纯度98.6%）、芦丁（批号110885-200102）、木犀草素（批号111520-200504），中国食品药品检定研究院；三裂鼠尾草素（批号MUST-15052611，纯度99.17%），成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher），其他试剂均为分析纯。
野生神香草药材于2014年8月采自新疆阿尔泰地区，由本所何江副研究员鉴定为唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss.的干燥地上部分。
2 方法与结果2.1 指标性成分检测方法2.1.1 紫外分光光度法测定总黄酮2.1.1.1 对照品溶液的制备取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含195.4 ?g的溶液，即得。
2.1.1.2 线性关系精密吸取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL置25 mL 量瓶中[8]，加无水乙醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加无水乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法[2015年版《中华人民共和国药典》（一部）附录0401]，在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=0.013 4X-0.006 3，r=0.999。
结果表明，总黄酮在11.72～46.90 μg/mL范围内线性关系良好。
2.1.2 HPLC测定迷迭香酸2.1.2.1 对照品溶液的制备取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含191.3 ?g的溶液，即得。
2.1.2.2 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-0.1%甲酸（23∶77），检测波长为330 nm，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃。
2.1.2.3 标准曲线精密吸取迷迭香酸对照品溶液0.15、0.5、1、2、4、6 mL 置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，摇匀，即得。
分别精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以迷迭香酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=0.370 5X-0.079 3，r=1。
结果表明，迷迭香酸在2.87～114.78 μg/mL范围内线性关系良好。
色谱图见图1。
2.2 聚酰胺树脂分离纯化工艺2.2.1 聚酰胺树脂预处理将聚酰胺树脂置于圆底烧瓶中，用95%乙醇加热回流提取3次，每次1 h，然后将树脂倒出并抽滤，在吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4～0.5倍乙醇，然后将聚酰胺树脂投入吸附柱中，使其液面至高于树脂约0.3 cm处，然后用2 BV/h乙醇淋洗树脂（应将树脂中的气体排出），并用蒸馏水以同样流速洗净乙醇，直到流出液没有醇味，备用。
2.2.2 上柱药液的制备取神香草药材粗粉适量，加入16倍量50%乙醇，提取3次，每次1 h，提取液浓缩至无醇味，然后加入适量的蒸馏水，搅拌均匀，过滤，制成适宜质量浓度的神香草提取液（含原药材48 mg/mL，其中迷迭香酸浓度9.13 μg/mL、总黄酮浓度117.8 μg/mL）后备用。
2.2.3 最大上样量考察取处理好的聚酰胺树脂3 g于1.5 cm×30 cm层析柱内，精密吸取上样液，以1 BV/h流速进行动态吸附，分段收集流出液，每4 mL 收集1份，收集6份后，每8 mL收集1份，用水定容至10 mL容量瓶中，共收集19份。
每份流出液依法测定迷迭香酸和总黄酮含量，绘制泄漏曲线，见图2。
可见，第4份收集样即第16 mL时，总黄酮开始明显泄漏（总黄酮泄漏率6.39%），故确定最大上样体积为12 mL上样液。
2.2.4 水洗脱体积及洗脱终点考察课题组前期进行的神香草抗哮喘有效部位谱效学研究结果显示，40%乙醇洗脱部位抗哮喘效果最好，所以本试验进一步考察水洗脱柱体积和洗脱终点。
取处理好的聚酰胺树脂3 g，湿法装柱后上样12 mL，以1 BV/h流速进行动态吸附，先后用2 BV水、3 BV 20%乙醇、5 BV 40%乙醇、5 BV 60%乙醇洗脱，每 1 BV为1份样品，分别计算各BV的吸附率和解吸率。
吸附率（%）=（C0V0-C1Vl）/C0V0×100%，解吸率（%）=C2V2/（C0V0-C1Vl）×100%。
C0为神香草提取液中指标成分的质量浓度，V0为神香草提取液体积，C1为残液中指标成分的质量浓度，V1为残液体积，C2为洗脱液中指标成分的质量浓度，V2为洗脱液体积。
结果见表1。
由表1可知，目标洗脱部位40%乙醇洗脱液中，迷迭香酸的吸附率=100%、解吸率<50%，还需继续考察40%乙醇洗脱体积；水洗脱液中含有大量总黄酮，随着水用量的增加，总黄酮损失率逐渐增加，综合考虑，确定水用量为2 BV。
2.2.5 40%乙醇洗脱柱体积考察取处理好的聚酰胺树脂3 g，湿法裝柱后上样12 mL，以1 BV/h流速进行动态吸附，依次用2 BV水、3 BV 20%乙醇、11 BV 40%乙醇洗脱，分段收集流出液，每1 BV为一流份，依法检测样品中迷迭香酸、总黄酮的吸附率和解吸率，结果见表2。