水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。

二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。

自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。

用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。

根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。

（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。

）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。

2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。

这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。

自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。

通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。

3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。

农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。

T-DNA区大小为10-30Kb，左右边界高度保守，为25bp正向重复序列。

根癌农杆菌进行转化时，只识别左右边界（尤其是右边界在转化时最为重要），而T-DNA区内为什么基因则不影响转化。

因此我们可以通过基因工程改造T-DNA区，转化目的基因。

毒性蛋白（Virulence）区：越20Kb，包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有些基因区含多个基因，形成操纵子结构。

毒性蛋白区在侵染植物细胞的过程中起重要作用。

4.农杆菌转化过程：1)植物受伤部位酚类化合物的分泌；2)附着（染色体毒性基因ChvA、ChvB）；3)VirA/G的双元系统感受受伤信号；4)其他 Vir基因的表达；5)T-DNA链的切出（VirD1+VirD2）；6)T-complex（T复合体）的形成；7)运输（从细菌中输出、进入植物细胞、入核）；8)整合。

植物受伤后的分泌物中含有酚类物质，这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性迁移至植物受伤部位，在ChvA、ChvB的帮助下，附着到受伤部位。

【因此在人工进行农杆菌侵染时，需要加入乙酰丁香酮（AS）吸引农杆菌，乙酰丁香酮即起到和植物受伤后分泌的酚类物质相同的作用。

】VirA识别植物受伤后分泌的酚类物质信号，进行自磷酸化，进而将磷酸化信号传VirG——这是典型的细菌双元信号传导系统。

VirG磷酸化后被活化，作为转录因子启动或增强各毒性蛋白的表达。

VirD2在 D1的帮助下识别T-DNA区25bp的边界序列，利用核酸外切酶的在第3、4碱基之间形成缺刻；VirD2的Tyr29与缺刻的5 ’端共价结合，DNA新链合成时便生成一条T-DNA单链，这条单链与VirD2和VirE2 结合形成T-complex。

T-complex通过细菌细胞壁上由11个VirB 蛋白和VirD4组成的通道从农杆菌进入植物细胞。

此外，VirD2含有NLS（核定位序列），能够引导T-complex进入细胞核，并帮助T-DNA插入植物染色体中。

VirE2是非特异DNA结合蛋白，包裹T-DNA单链，使DNA由随机卷曲状态转变为规则螺旋，这种形状使T-complex 容易穿过核孔。

此外，VirE2将T-DNA包裹，还可避免T-DNA从细菌向植物转移过程中被降解。

VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex进入植物细胞；VirE2虽不含NLS序列，但亦可促进T-complex向核定向转运。

5.Ti质粒的改造：Ti质粒只有被解甲之后才能被应用于转基因实验中。

所谓解甲，是指去除对转基因有不良影响的基因，如生长素、细胞分裂素合成基因等。

现使用的工程菌株均使用双元载体。

双元载体由存在于工程菌株中的大质粒和方便体外操作的小质粒组成。

大质粒包含Vir区，负责侵染植物细胞、帮助T-complex转运等；小质粒约十几Kb，方便体外操作，包含T-DNA区、筛选标记等。

实际应用时，将目的基因插入T-DNA区即可。

三、实验用品1、实验仪器：镊子、灭菌滤纸、移液器、平皿、离心管、离心机、三角瓶、EP管、摇床、分光光度计、超净工作台等；2、实验材料：日本晴水稻种子、 EHA105农杆菌；3、实验试剂1)0.1% 升汞，无菌水等2)抗生素：利福平（Rif）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）3)培养基：①N6培养基：② YEP 培养基③ 侵染培养基：N6D2（N6加2mg/L 2,4-D ）液体培养基+AS （100μM ） ④ 共培养培养基：N6D2+AS （100μM ）固体培养基⑤ 筛选培养基1（初次筛选）：N6D2+Cef （600mg/L ）+Hyg （25mg/L ）固体培养基 ⑥ 筛选培养基2（二次筛选）：N6D2+Cef （300mg/L ）+Hyg （50mg/L ）固体培养基 ⑦ 分化培养基：N6+6-BA+NAA+Cef （300mg/L ）+Hyg （50mg/L ）固体培养基四、实验步骤（一）水稻愈伤组织的诱导：1. 水稻种子去壳，0.1%升汞消毒2. 滤纸吸干水分，将种子置于 N 6D2固体培养基上 25℃暗培养诱导愈伤组织；一周时去除长出的芽；3. 愈伤组织长至较大时（约 2周）继代，培养至 7天用于转化。

（二）农杆菌活化4. 早上取甘油保存的农杆菌，加至 3-5 ml YEP 液体培养基中（含利福平 R if25mg/l 和卡那霉素K an 50mg/l ），28℃培养至晚上； 5. 农杆菌培养物，按 200至 500倍左右稀释，加入不含抗生素的 Y EP 液体中，28℃过夜培养； 6. 测量 O D600，培养至 0.5左右；（三）农杆菌浸染及共培养7. 将农杆菌培养物转移至灭菌离心管中，管壁标记液面位置，离心收集菌体；8. 弃上清，倒置离心管，流尽剩余的 Y EP ；9. 加入含 100μM 乙酰丁香酮 （AS ）的 N 6D2 液体培养基至标记位置，彻底重悬菌体（可先加入少量 N 6D2，重悬后将剩余的加入）； 10. 静置 2h ，期间收集待转化愈伤组织；11. 将愈伤组织加入农杆菌悬液中，晃匀，静置 30 min ；12. 倒掉多余液体，愈伤组织转到灭菌滤纸上，超净台吹 15～20 min ；13. 将愈伤组织转到含 100μM 乙酰丁香酮 N 6D2固体培养基上，培养基上垫 一层灭菌滤纸； 14. 黑暗中 25℃度共培养 3天；（四）筛选15. 用含 300mg/L 头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织 3-5 次，每次 10min ，不断摇 晃；洗至液体澄清（约需 4-5次）； 16. 用灭菌滤纸吸干多余愈伤组织转到含 600 mg/l 头孢霉素 C ef 和 25 mg/l 潮霉素 H yg 的 N 6D2 固体培养基（筛选培养基Ⅰ）上，筛选 2周（可缩短至 10天），期间注意去除有农杆菌增殖的愈伤组织块； 17. 愈伤组织转到含 300 mg/l 头孢霉素 （Cef ）和 50 mg/l 潮霉素（Hyg ）的 N 6D2固体培养基（筛选培养基Ⅱ）上，筛选2周；（五）植株再生18. 将筛选获得的 H yg 抗性愈伤组织转移到含 3mg/l 6-BA 和 0.5 mg/l NAA 的 N6 培养基（不含 2,4-D ）,2（以下步骤未进行） 19. 将含绿点或小植株的愈20. 2-4 周后，将茁壮的再生植株移出，室内水培壮苗2-3 天后，移栽至土中， 苗期水刚好没过土即可。

（六）鉴定21. GUS 染色：在生长状态良好的克隆上夹取少量愈伤组织，放入EP 管中，加入少量X-Gluc 染液至没过材料，37℃过夜染色；（以下步骤未进行）22.PCR检测：过程略。

五、实验结果1.愈伤组织诱导2.二次筛选平板（色泽浅而鲜艳的愈伤为阳性）。

从二次筛选的结果看，转化率在60%左右。

这些克隆在后续实验中大多可以继续生长愈伤，但随机选取4个克隆进行GUS染色均为阴性。

实际的转化率，应小于二次筛选的统计。

3.愈伤组织的再分化（已可见绿点，是再分化的标志，会长成芽）4.GUS染色鉴定（有愈伤组织被染成蓝色，证明是阳性克隆）六、结果分析及总结总体来说，整个实验下来，我们基本掌握了水稻组织培养、转基因及鉴定的方法。

整个过程是曲折的，我们走了很多弯路。

或许一学期刚刚做到再生植株是挺慢的，但整个实验在徐老师的指导下，都是由我们自己独立完成的，得与失都是我们实验的经历——这些远比最后的结果更有价值。

首先，无菌意识是我在整个试验中时刻不敢松懈的。

组培的前提是无菌操作，它保证了整个实验的顺利进行。

在第一次诱导愈伤的时候，大家的污染情况十分严重，有的组甚至是全军覆没。

但是到了实验后期，材料染菌的情况就只是零星出现了，这使我们大家都十分欣喜。

第二是培养基的问题。

培养基也是组培的基础，但是它的问题有时是不容易确定的。

在1L培养基中多加或是少加了1g蔗糖，究竟有没有影响？是好还是坏的影响？我也无法回答。

但是我们不能存有侥幸心理，而必须严格每一步的操作。

不仅是试剂的称量，也包括试剂的溶解、添加的顺序、pH的调节等问题。

当一批材料出现普遍性的问题时，我们就需要考虑培养基的问题，是需要改良培养基还是培养基在配置中出现问题。

这个实验中的N6培养基是早已被验证过的，我们第一批材料愈伤诱导率低，应该是培养基配的不够好。

在更换商业化的N6粉末后，问题得到了显著改善。

第三点，我认为应该重视实验材料。

只有对实验材料的认识足够清晰，才能有针对性的做好每一步实验。

一开始种子的选择，要选取饱满的种子，剥壳时注意不要损伤到胚。

在之后多次培养中，要清楚是光下培养还是暗培养。

培养温度也是重要的条件，温度的小幅度变化可能不会决定实验的成败，但会影响实验的时间及材料的生长状况。