MtPAR MYB转录因子作为一个开关参与苜蓿原花色素的合成摘要：MtPAR（蒺藜苜蓿原花色素调节子）是myb蛋白家族的转录因子，在模式豆科植物苜蓿的原花色素（PA）的合成中起关键调控作用。

MtPAR在种皮中表达，pa积累的部位。

功能缺陷的Par突变体种皮中的pa含量比野生型低很多，然而花色素和其他专门的代谢物水平是正常的。

相反，当MtPAR在转基因苜蓿的毛状根中异常表达时，pa却大量积累。

对par突变体和MtPAR表达的毛状根进行转录分析，结合酵母单杂交分析，发现MtPAR 很可能通过激活WD40-1，从而正向调控编码类黄酮到pa合成途径中的酶的基因。

MtPAR 在牲畜饲料的紫花苜蓿中表达，导致根中含有可观察到的pa含量，突出了这一潜在增加牧草植物中pa含量的基因生物技术的战略，降低以此为食的反刍动物的气胀。

原花色素（pa，也成缩合单宁）是黄烷-3 -醇单元的低聚物，pa复合物在种皮，叶，果实，花，许多植物的树皮中都有分布。

Pa，儿茶素，表儿茶素是对人体健康有益的抗氧化剂，包括保护心脏，抗癌，消炎。

牧草植物中的Pa与蛋白结合，减慢在反刍动物的瘤胃的发酵，降低了微生物产生的甲烷含量，从而使动物免受可能致死的气胀病的危害。

牧草植物中等水平的pa含量，可以改善氮素营养，减少尿氮排泄，有利于抵抗肠道寄生虫。

不幸的是，很多豆科植物，包括世界上最重要的牧草植物，紫花苜蓿，没有足够多的pa来抵抗食草动物的胀气病。

因此，提高苜蓿和其他饲料豆科植物根中pa含量成为生物技术的一个重要目标。

Pa的合成和调控在非豆科植物的模式植物拟南芥中已研究清楚。

拟南芥中pa的合成知识大部分来自于tt突变体，表现为种子色素沉着较少。

20个tt基因已被鉴定，它们编码参与pa 合成及储存或者调控pa产量的蛋白的酶或者转运子。

转运子包括一系列的转录因子：tt2，myb家族的转录因子；tt8，bHLH转录因子；ttg1，WD40蛋白，共同组成一个调控花色素还原酶转录的三聚体。

最近，已经从模式豆科植物苜蓿中分离和鉴定了参与pa合成的几个关键的基因/酶和一个转运子的前体。

然而，我们对苜蓿和其他豆科植物pa的生物合成知之甚少，，只有一个WD40重复结构的转录因子有牵连，在紫花苜蓿种子的正调控pa的合成。

苜蓿的全基因组转录因子研究和其他在种子发育过程中被激活的基因中，锁定了超过30个诱导种子的转录因子用于反向遗传学功能鉴定。

其中一个编码调控苜蓿种子pa合成的myb蛋白家族的转录因子。

这个基因在转基因毛状根的异常表达导致pa合成和积累。

因此，这个myb转录因子具有提高牧草单宁水平的潜力。

结论：MtPAR编码一个在种皮中特异表达的myb转录因子图1：MtPAR基因的表达。

MtPAR在种子发育不同阶段和在种子不同组织中的表达情况。

我们使用了苜蓿的基因表达谱来筛选诱导种子的转录因子基因用于遗传鉴定。

其中之一，MtPAR，编码一个假定的R2R3类的myb转录因子，基于其蛋白N末端高度保守的R2和R3 myb DNA结合结构域。

MtPAR仅在种子中表达，授粉后24天表达量最高。

定量rt-pcr 表明这个基因在种皮中特异表达，在胚和成熟种子的胚乳中不表达。

距离分析，没有发现MtPAR和参与花青素或者pa合成的myb转录因子之间有密切联系。

最接近同源的MtPAR 是大豆里一个功能未知的myb蛋白。

Par突变体在种皮pa积累中是有缺陷的我们通过转座子插入MtPAR基因分离了四个独立的突变体。

群体中在NF4419的第二个外显子中，NF2466，NF1358，NF3308的第三个外显子中发现了Tnt-1插入。

与野生型相比，这四个插入突变体分离得到的纯合株系的成熟种子色素沉着减少。

在发育种子中，四个突变体的MtPAR转录水平不到野生型的5%。

图2：苜蓿par突变体分析A：不同的Tnt-1插入MtPAR的位置和相应的突变体株系的名称。

线表示内含子，矩形表示外显子。

B：NF4419突变体株系中突变对种子色素沉着的影响。

在另一个突变体株系中也观察到了相似的表型变化。

C：NF2466突变体株系成熟种子的dmaca染色D：提取物中pa水平（可溶的和不可溶的）与各自相应的对照。

Dmaca染色表明，与野生型相比，突变体的成熟种子中pa含量降低。

发育种子的Dmaca 染色表明，在授粉后10天到16天中，突变体和野生型pa含量都呈现出相似的，逐渐积累。

授粉后20-24天，突变体和野生型之间的差异开始明显，这个现象与野生型的MtPAR在授粉后24天后表达量最高相一致。

电镜观察突变体和野生型种子dmaca染色的横切面，很大程度上局限在种皮，表明MtPAR表达的组织特异性。

par突变体种子的可溶解的和不可溶解的pa水平都低于各自的对照，突变体可溶解的pa含量比对照低50%，不溶解的pa含量比对照低80%。

高效液相色谱分析表明，par突变体和野生型的各种pa二聚体分布相似。

花青素的分光光度分析表明，par突变体和野生型种子没有明显差异。

结论，MtPAR调控的是种子中pa，而不是花青素。

MtPAR异常表达诱导pa合成图3：在苜蓿毛状根中过表达MtPARA：过表达MtPAR转化株的毛状根的表型。

左：gfp作为转化标记。

中和右：dmaca未染色和染色的毛状根B：在14个不停毛状根转化体中可溶pa和花青素浓度与MtPAR表达水平的相关。

为了探究MtPAR在pa合成中的作用，我们使用了组成型表达启动子35S结合MtPAR 的cDNA来转化苜蓿的毛状根。

利用土壤农杆菌来转化含有使转化的毛状根可见的gfp标记和p35S:: Mt PAR载体到苜蓿中。

通过qRT-PCR检测苜蓿毛状根中MtPAR的异常表达。

观察最初的未染色的毛状根发现，与转化p35S::GUS的毛状根相比，p35S::Mt PAR的红色较浅。

在根生长和其他形态学特征中没有观察到p35S::GUS和对照有明显的差异。

然而，随后用dmaca染色后观察，发现p35S::Mt PAR和p35S::GUS有了明显的差异，前者用dmaca 染色后电镜显示为蓝绿色，暗示pa的存在，然而对照却没有。

可溶的pa水平在对照p35S::GUS转基因植物的毛状根中含量很低，但比p35S::Mt PAR 含量高100倍以上。

此外，可溶的pa浓度和MtPAR的转录水平成正相关。

相反，不溶解的pa水平在对照转基因植株毛状根中含量很低，并没有因为MtPAR的表达而增加。

花青素浓度在对照转基因植株毛状根中含量高，但是在p35S::Mt PAR株系中，随着可溶的pa水平增加，花青素浓度降低。

MtPAR调节pa合成基因的表达为了研究MtPAR引发pa生物合成的机制，我们使用基因芯片对突变体和野生型种子，p35S::Mt PAR和p35S::GUS转化的根进行转录组分析。

比较授粉后20天种子的转录水平，发现了49个在par突变体和野生型差异表达的基因。

其中，与野生型相比，par突变体38个基因的转录水平低，11个基因的转录水平高。

根据GeneBins ontology，14个在突变体中被抑制的基因编码参与原花色素合成的酶。

有些事pa和花青素合成都需要的（例如，查尔酮合酶，chs；类黄酮-3-羟化酶，f3h；花色素合酶，ans），然而其他基因在ans下游起调控作用，只调节pa的合成。

在突变体中表达水平高的基因大多功能未知。

在转p35S::Mt PAR的苜蓿毛状根中，171个基因表达水平明显不同于对照p35S::GUS。

其中，115个基因表达水平高于对照。

115个基因中的11个编码类黄酮合成的假定的酶。

为了确定MtPAR直接调控的基因，我们把突变体中被抑制的基因与转化p35S::Mt PAR 植株中被诱导的基因进行了比较。

12个基因同时满足两个条件，8个编码参与pa和花青素合成途径的酶。

这些编码ans和anr的基因，表茶儿酸合成的最后两步，影响苜蓿中pa的合成。

使用突变体种子和毛状根的异常表达的转录本数据，综合分析类黄酮合成途径中所有基因家族成员的表达。

此分析确定了MtPAR对类黄酮合成途径中两个中心酶（chs和f3h），一个特殊调节pa和花青素合成的开关的酶ans的调控作用。

图4：MtPAR在类黄酮途径调控中的作用。

A：类黄酮生物合成途径到pa和花青素的流程图。

*表示转录水平在突变体株系和过表达株系中都受到显著影响的酶。

B：授粉后20天的par突变体种子和过表达株系中参与类黄酮合成的假定基因的渐增表达情况。

C：相比野生型对照，par突变体成熟种子中显著变化的代谢物含量。

为了评价par突变体在类黄酮代谢途径的影响，我们使用uplc和ms进行了代谢物分析。

成熟种子中鉴别出74个有关的代谢物，与野生型相比，par突变体的19个代谢物变化显著。

这些代谢物主要属于四类复合物：香豆酸和香豆素化合物，三萜皂苷，表儿茶酸和类黄酮配糖类，分别有2个，8个，2个和7个。

尽管各自的皂苷类代谢物在par突变体中不同，突变体和对照的皂苷类的总量并没有显著差别。

香豆素和香豆酸也是同样情况。

相反，突变体的表茶儿酸含量比野生型低了45.9%，类黄酮配糖含量比野生型高23.2%。

在par突变体中表儿茶酸减少的量反映了可溶解pa水平的降低。

总之，遗传学，转录本和代谢分析的结果表明，苜蓿的MtPAR在pa合成中起着正调控作用。

MtPAR作用于WD40-1上游之前，在苜蓿中发现一个WD40重复结构蛋白，与拟南芥TTG1基因同源，称为MtWD40-1.苜蓿WD40-1突变体的可溶和不溶pa含量急剧下降。

然而，在苜蓿毛状根中过表达MtWD40-1，花青素浓度升高，pa浓度没有受到影响。

我们读MtWD40-1突变体和par 突变体进行了对比。

相比野生型对照，par突变体有38个基因在授粉后20天的种子中下调，，wd40-1突变体有16个基因在授粉后16天种子中下调。

此外，这16个基因中有14个与花青素合成有关。

为了检验Mtpar和MtWD40-1是否通过一个共同的途径诱导目标基因，我们做了定量pcr来检测par突变体中WD40-1的表达。

显然，授粉后20天的种子，不同的par突变体的wd40-1的转录水平比野生型低15-50倍。

相反，在授粉后16天种子中，par 转录水平并没有因为wd40-1的突变而受到影响。

此外，过表达MtPAR诱导了苜蓿毛状根中MtWD40-1的表达。

我们随后做了酵母单杂交来研究par，wd40-1和anr启动子之间的直接互作。

MtPAR激活了wd40-1启动子的转录，而不是anr启动子。

图5：par激活WD40-1的表达A：不同突变体株系中授粉后20天种子中MtWD40-1的表达情况。

B：毛状根转化体中MtWD40-1的表达情况。

AB：两个看家基因MSC27和PDF2的表达情况。