脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。
Zuk等[1]从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中最先分离培养出多向分化潜能的干细胞。
研究发现，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。
人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，随着整形美容业的迅猛发展，重睑手术所得的眶隔脂肪组织也随之增多，给ADSCs的取材提供了新的路径。
本研究主要探讨人上睑眶隔脂肪来源的脂肪提取ADSCs的可行性。
1材料与方法1.1脂肪组织来源本研究所用脂肪组织来自于潍坊医学院整形外科医院重睑手术者，均为女性，年龄18~30岁。
1.2主要试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Hyclone公司）等。
1.3ADSCs的分离培养及传代将取出的脂肪组织放于无菌盘中，用PBS冲洗3遍，然后用无菌眼科剪刀剔除血管、筋膜等组织，再用PBS冲洗3遍。
把修剪好的脂肪组织放入盛有高糖DMEM（无血清）的无菌培养皿中，用眼科剪刀将脂肪剪成糊状，置于离心管中。
室温下离心（1200r/min）10min。
离心后可见离心管中液体分层：上层为白色泡沫，中层为清液，下层为黄色脂肪。
吸取上、中层丢弃。
加入3~5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶和胰酶混合液（1∶1），将沉积于离心管底部的脂肪组织振荡打散，拧紧离心管后，用封口膜包裹，放入37℃恒温摇床中振荡（190r/min）消化30min。
将离心管自摇床中取出，肉眼观察可见无明显脂肪颗粒、白色泡沫贴壁，将液体用200目筛网过滤，滤液离心（1200r/ min）10min。
弃上清液，用PBS冲洗3遍，加入含有10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度1.0×105mL-1接种于培养瓶中，在5%CO2、37℃标准环境下培养。
48h后首次换液，去除未贴壁细胞，此后每3天换液1次，待细胞融合80％~90％时进行下一次传代。
在传代过程中采用差速贴壁法纯化ADSCs，即加入胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，经吹打、离心后，以细胞密度1.0×105mL-1接种在培养瓶内，置于孵箱内培养，4h后弃掉培养皿内DMEM培养基，细胞换液1次，继续在37℃、5%CO2条件下培养。
1.4ADSCs的鉴定1.4.1细胞形态观察（HE染色）取第3代细胞，以细胞密度5.0×104mL-1接种于12孔细胞培养板上，用细胞爬片法使细胞生长到盖玻片上，培养一段时间，待细胞长满盖玻片，取出，用PBS冲洗3次，将长有细胞的盖玻片放入95%乙醇中固定15min；PBS冲洗2次，每次1min；浸入到苏木紫中染色5~10min；用自来水冲洗干净，浸入到稀盐酸乙醇溶液中进行分色，数秒钟即可；再用自来水浸洗，然后侵入到淡氨水中，使细胞核蓝化3~5min；自来水冲洗，浸入伊红染液中染色3~5min；自来水冲洗，然后经70%、80%、90%乙醇脱水各1次，95%乙醇2次和100%乙醇3次逐级脱水，各1min；二甲苯透明3次，每次1min。
然后用中性树胶封人上睑眶隔脂肪来源的脂肪干细胞的分离培养及鉴定范开防，王国栋，刘兴龙，杨彪炳（潍坊医学院整形外科研究所，山东潍坊261041）【摘要】目的探讨人上睑眶隔来源的脂肪提取脂肪干细胞（ADSCs）的可行性，并进行分离、培养及鉴定。
方法取健康成年人上睑眶隔脂肪组织，用胰酶进行消化后收集细胞接种于培养瓶内，采用差速贴壁法纯化细胞。
用HE染色、免疫荧光进行细胞鉴定，并进行成脂、成软骨诱导。
结果HE染色显示细胞形态为长梭形，呈漩涡状生长。
免疫荧光鉴定结果显示细胞表面抗原CD44、CD29阳性表达，CD106、CD34阴性表达，说明分离培养的细胞是脂肪干细胞。
成脂、成骨诱导实验证明所得细胞有多向分化的能力。
结论可以从人上睑眶隔脂肪组织提取出ADSCs，并有多向分化能力，为今后ADSCs的取材提供了新的路径。
【关键词】干细胞；脂细胞；脂肪组织；眼睑；细胞，培养的；分离；鉴定文章编号：1009-5519（2012）19-2881-02中图法分类号：R457.7文献标识码：AIsolation culture and identification of adipose-derived stem cells separated from upper eyelid orbit septum fat of human beings Fan Kaifang，Wang Guodong，Liu Xinglong，Yang Biaobing（Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College，Weifang，Shandong261041，China）【Abstract】Objective To investigate the feasibility of extracting adipose-derived stem cells（ADSCs）from the human upper eyelid orbital fat tissue and to perform the isolation，culture and identification.Methods The upper eyelid orbital fat tis-sues of healthy adults were collected.After digestion by trypsin，the collected cells were seeded in culture flask and purified by differential adherence method.These cells were identified by HE staining and immunofluorescence，and performed the adipose and cartilage induction.Results These cells were long fusiform shape and swirling growth by HE staining.The immunofluores-cence showed that these cells were positive for CD44and CD29and negative for CD106and CD34.Adipogenic and cartilage in-duction experiments indicated that these cells were capable of multilineage differentiation.Conclusion It is feasible that ex-tracting ADSCs from the human upper eyelid or bital fat tissue and ADSCs have the multipotent differentiation ability，which provides a new approach to obtain ADSCs in the future.【Key words】Stem cells；Adipocytes；Adipose tissue；Eyelids；Cells，cultured；Isolation；Identification基金项目：山东省高等学校科技计划资助项目（J09LF20）。
通讯作者：杨彪炳（E-mail：Ybiaobing@）。
片，在电子显微镜下观察并拍照。
1.4.2MTT 生长曲线测定取第3代细胞，待细胞长至80%~90%融合后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度2.5×104mL -1接种到96孔培养板中。
每组设5个复孔，1个空白对照孔，共接种8块培养板。
每天取1块培养板在酶联免疫检测仪OD 490nm 处测量各孔的吸光值。
以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.4.3免疫荧光染色采用常规免疫荧光法进行ADSCs 表面标志鉴定，取第3代细胞进行爬片，以细胞密度2.0×104mL -1接种于24孔板中，每孔加入500μL DMEM 培养基，置于37.0℃、5%CO 2培养箱内培养，待细胞60%~70%融合后进行细胞鉴定。
取4孔细胞，弃去DMEM 培养基后用PBS 冲洗3遍，用滤纸吸干细胞表面液体。
然后加入4%多聚甲醛500μL 固定10min ，再用PBS 冲洗3遍。
加入山羊血清封闭液室温孵育30min ，弃封闭液，滤纸吸干细胞表面液体。
分别向4孔内滴入一抗CD29、CD44、CD34及CD106兔抗人多克隆抗体300μL （1∶100），4℃孵育过夜（14~16h ）。
第2天弃一抗，PBS 冲洗3遍，每孔加入山羊抗兔异硫氰酸荧光素（FITC ）标记的二抗300μL （1∶200），室温避光孵育2h ，弃二抗，PBS 冲洗3遍，每次15min ，甘油封片，在荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.4成脂、成骨诱导实验（1）向脂肪细胞诱导分化：取第3代细胞接种于12孔培养板中，第2天弃DMEM 培养基，换含有胰岛素10mg/L 、吲哚美辛0.2mmol/L 、伊菠丁基甲基黄嘌呤（IBMX ）0.5mmol/L 、地塞米松1μmol/L 的DMEM 诱导液诱导培养1周左右，用油红O 染色鉴定。
（2）向成骨细胞诱导分化：取第3代细胞接种于12孔培养板中，第2天弃DMEM 培养基，换含有维生素C50μmol/L 、β磷酸甘油钠10mmol/L 、地塞米松10μmol/L 的DMEM 诱导液诱导培养，每3天换1次液，3周后行茜素红染色。
2结果2.1ADSCs 形态学观察倒置显微镜下观察经消化后搜集到的原代细胞起初为透亮的小圆形，4h 后开始贴壁，贴壁后的细胞逐渐伸展开，体积也随之增大，多为短梭形或小多角形，24h 后存活细胞基本贴壁。
4d 左右可见细胞开始分裂增殖，随着时间的延长细胞逐渐伸展成长梭形外观。
7d 左右细胞铺满瓶底，呈鱼群样或螺旋状生长（图1）。
经传代后，细胞形态均匀，以长梭形为主。
核居中，多数为1个核仁，也有少数双核，核呈圆形或椭圆形。
随着传代次数的增加及用差速贴壁法进行细胞纯化，混杂生长的细胞逐渐减少，传至第3代细胞时能得到较纯的ADSCs 。