NtDHN17蛋白
生化性质 无序性
研究方法
高温诱导变性沉淀 胰蛋白酶敏感实验
亲水性
蛋白聚集沉淀实验
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
NtDHN17蛋白无序结构验证-热稳定性
热聚集实验表明NtDHN17蛋白具有无序蛋白 典型特征，在高温处理后不发生聚集沉淀； 与锌离子结合后，获得高级构象，失去了 无序蛋白在高温条件下保持水溶性的特征。
TCA-element
TGACG-motif
水杨酸响应元件
茉莉酸响应元件
4
3
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析
小结
RACE - contig1045 - NtDhn17 NtDhn17基因在正常生长植物体内存 在本底表达 NtDhn17基因受ABA；自然干旱和高 渗胁迫；JA和SA；过氧化氢；微生 物代谢产物（DMP）上调表达
无序蛋白的基本特征
• 以无序卷曲的形式存在于水溶液中
二级结构名称 α-螺旋 β-折叠 γ-转角 无序卷曲 Total
占肽链的百分百 (%) 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
无序蛋白的基本特征
• 高温处理不发生沉淀
无序蛋白热稳定性分析 MpASR热稳定性分析
BSA BSA (-) (+)
参与生物胁迫的脱水蛋白
参与生物胁迫的脱水蛋白
小结
• 脱水蛋白在非生物胁迫过程中发挥重要作用，具有 多种功能。有些脱水蛋白可能同时发挥多种功能， 而一些脱水蛋白只能发挥单一功能。
• 结合酸性磷酸脂、离子和抗冻保护能力被认为是脱 水蛋白的基本功能。
• 逆境胁迫和病害是影响植物生长发育的一个重要因 素，深入研究脱水蛋白在非生物胁迫和生物胁迫中 发挥的确切功能不仅有助于更全面的了解植物应对 逆境胁迫的机制，还能为开发脱水蛋白在作物改良 中的应用奠定理论基础。
DHN(-)表示未经热处理的NtDHN17蛋白； DHN(+)表示经100℃热处理30分钟的NtDHN17蛋白； DHN-Zn2+(+)表示与锌离子结合后热处理30分钟的NtDHN17蛋白； BSA(-)表示未经热处理的BSA蛋白； BSA(+)表示经100℃热处理30分钟的BSA蛋白； BSA-Zn2+(+)表示与锌离子结合后热处理30分钟的BSA蛋白；
•在线工具
•http://prdos.hgc.jp/cgi-bin/top.cgi
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
小结
NtDHN17蛋白是一个Y2SK2类中性脱 水蛋白 NtDHN17蛋白二级结构以无序卷曲 为主 NtDHN17蛋白是一个高度亲水的无序 蛋白
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
与大分子结合的脱水蛋白
• 脱水蛋白高度保守结构基元——K片段可以形成 双亲性α-螺旋，与大分子膜脂结合
• 利用去垢剂，可以从膜碎片小泡中分离到脱水蛋 白 • 氨基端的Y-片段含有核酸结合结构域，因此脱水 蛋白还可能与核酸结合
• 柑橘脱水蛋白CuCOR5具有锌离子依赖的核酸结 合功能
• 与核酸的结合不是脱水蛋白的保守功能
• 值得引起注意的是，SA和JA通常与植物抗生物胁 迫相关 • 同时，Turco等人发现在抗旱栎树Quercus ilex受 到疫霉菌Phytophthora cinnamomi侵染时，会表达 若干个类脱水蛋白 • 这些实验结果均表明，除了参与水分胁迫外，脱 水蛋白还可能与生物胁迫相关
参与生物胁迫的脱水蛋白
• 各种逆境胁迫还会引起活性氧的积累 • 活性氧首先是对生物膜系统造成损伤，导致细胞膜过氧化， 超氧化物歧化酶和其他清除自由基的酶类活力下降，同时 产生大量的膜脂过氧化产物，破坏膜脂的完整性和稳定性； 膜系统的破坏会引起一系列生理生化紊乱。ROS还对生物 大分子如蛋白质和核酸造成氧化损伤 • 脱水蛋白具有与活性氧分子结合的能力，对柑橘 CuCOR19蛋白的研究表明，CuCOR19蛋白能特异结合羟 基自由基和过氧化自由基的能力，羟基自由基作用的靶位 点主要是Gly、His和Lys，而脱水蛋白中富含这些氨基酸， 因此脱水蛋白可能在活性氧爆发的情况下通过自我牺牲的 方式消耗活性氧从而保护其它蛋白质免受损伤
Dehydrin
•烟草Annotations Nicotiana tabacum Genbank 050206 •2个注释为脱水蛋 白基因克隆 •contig1045 •contig9354
•RACE
•自然干旱处理 •克隆到contig1045 基因 •编码蛋白-17kDa •NtDhn17
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析
ห้องสมุดไป่ตู้ 脱水蛋白相关背景
LEA蛋白-第2组
-1980s，第一次报道脱水蛋白
-Late embryogenesis abundant protein, 第2组
三个保守片段
-Y，S和K片段
-5个亚类(Kn、SKn、KnS、YnKn和YnSKn )
脱水蛋白相关背景
碱性或酸性 干旱&ABA 酸性 低温&干旱 酸性或中性 低温 酸性 干旱&低温 酸性 低温
• 空间优越性：无序结构可以节省空间，未折叠多肽在细胞 中所占据的空间与具高级结构的大分子相比要小的多；当 多个蛋白质同时结合于某一位点时，无序结构可以使这种 结合更紧密；同时还有利于完成互作后，不同成分的转换
• 高度协调性，大范围、多组分的互作结合需要高度的协调， 无序蛋白中所含的多个重复结合基序可以有效地协调蛋白 间的相互作用，使得大分子的组装与分解更加高效
植物与非生物逆境胁迫
植物与非生物逆境胁迫
膜脂相变 排列紊乱 形成孔隙 脂质过氧化 疏水基团外翻 从膜上脱落
流动性降低 膜脂、蛋白解体 细胞内容物外漏 离子、渗透平衡破坏
第一个脱水蛋白的发现
1989年
ABA处理 的大麦胡 粉粒
&
干旱处理 的玉米幼 苗
4个干旱诱 导蛋白
脱水蛋白 Dehydrin
植物应对逆境胁迫的代谢和分子基础
• NtDHN17亚细胞定位——细胞核
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
原核表达获得体外重组NtDHN17蛋白
200kDa 100kDa
50kDa
30kDa 25kDa
IPTG浓度
诱导时间
过柱纯化
预测大小：17.7kDa SDS-PAGE：~25kDa 无序蛋白特征之一：迁移率
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
• 小麦脱水蛋白DHN-5异源表达于拟南芥中 时，不仅可以帮助植物抗水分胁迫，还具 有多重抗胁迫功能 •
参与生物胁迫的脱水蛋白
• DHN-5异源过表达还影响了茉莉酸(JA)信号通路
• 茉莉酸ZIM结构域(JAZ)家族三个成员，JAZ10、 JAZ7和JAZ5均下调表达2.5至10倍不等 • 病程相关蛋白家族的PR1、PR13和PR14的转录分 别上调2、2.6和3.38倍 • DHN-5转基因株与野生型相比更加耐受JA的处理
contig1045片段的获得
contig1045克隆的cDNA全长及编码蛋白序列
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析 表达谱分析
DMP,青霉菌灭活菌丝体,微生物代谢产物,植物系统抗病性诱导剂
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析 启动子分析 启动子序列克隆-热不对称PCR
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析 启动子分析
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
NtDHN17二级结构预测
•二级结构以无序卷曲为 主 •在线工具
•HNNC、MLRC、PHD和 Predator
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
•NtDHN17蛋白由169个氨基酸组成 •为Y2SK2类脱水蛋白
•NtDHN17(MW):17,773Da •MtDHN(pI):6.81
与大分子结合的脱水蛋白
• 利用哺乳动物纤维母细胞筛选系统的研究表明拟 南芥ERD10与COR47是与细胞骨架互作的蛋白
• ERD10可以直接与肌动蛋白微丝结合，抑制肌动 蛋白聚合 • 磷脂质，核酸和细胞骨架这一类的大分子是细胞 遭受胁迫时比较敏感的大分子。对脱水蛋白的研 究表明，与这些大分子的结合可能是脱水蛋白在 植物细胞遭受胁迫时发挥保护功能的关键
YSK类脱水蛋白保守结构域比对
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
NtDHN17蛋白氨基酸序列分析
•Gly 21.3%,亲水值 >1 •NtDHN17蛋白是亲水素 •在线工具
•/molkit/ hydropathy/index.html
NtDHN17蛋白无序性预测 •NtDHN17是无序蛋白 •80%氨基酸序列为无序结构
启动子顺式作用元件分析及表达活性检测
顺式作用元件名称 ABRE ATCT-motif BoxI BoxIII Box-W1 CGTCA-motif G-Box GARE-motif HSE MBS TC-rich repeat 可能的功能 响应ABA 光响应元件 光响应元件 蛋白结合位点 真菌激活子响应元件 茉莉酸响应元件 ABA响应元件 赤霉素响应元件 分子伴侣结合元件 干旱响应元件 生物胁迫响应元件 出现频率 2 1 1 1 2 3 4 2 2 3 3
• 脱水蛋白具有活性氧结合与清除能力
与小分子结合的脱水蛋白
• 脱水蛋白还可以与水分子结合
• 在水分胁迫细胞中维持水分，维持渗透压 • 保护蛋白在细胞内离子平衡打破时不发生 变性
脱水蛋白可能发挥功能示意图
参与生物胁迫的脱水蛋白
• 不同的研究小组发现，水杨酸(SA)和茉莉酸(JA) 可以诱导特殊的脱水蛋白如厚叶旋蒴苣苔的 BcDh2表达
与小分子结合的脱水蛋白
• 水分胁迫可能引起从细胞器或膜上释放金 属离子，从而导致细胞内自由金属离子浓 度增大，而脱水蛋白与金属离子的结合可 以减轻由自由离子造成的伤害——金属离 子结合性 • 分离得到的玉米胚的Rab17蛋白是磷酸化形 式的，这是第一次报道脱水蛋白的磷酸 化 ——与磷酸基团结合性