2013年1月Vol．31No．1January2013ChineseJournalofChromatography53～58

研究论文DOI:10．3724/SP．J．1123．2012．08013

*通讯联系人．Tel：（0571）88982729，E-mail：yzwang@zju．edu．cn．基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-36）．收稿日期：2012-08-14

气相色谱-质谱联用同时分析新型细菌多糖中的单糖和糖醛酸王凤芹，杨航仙，汪以真*（浙江大学饲料科学研究所，农业部华东动物营养与饲料重点实验室，浙江省饲料及动物营养研究实验室，浙江杭州310058）

摘要：对纯化的新型细菌多糖进行酸水解，用乙硫醇-三氟乙酸和醋酐-吡啶体系先后对酸水解物进行衍生，与之前报道不同的是糖醛酸得到有效衍生化。以木糖为内标，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）定量分析该多糖酸水解物中单糖和糖醛酸衍生物发现，该多糖的糖链由岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成，其相对物质的量比为1．50∶1．0∶0．79∶2．06；中性糖比例与糖醇乙酸酯化分析岩藻糖、葡萄糖和半乳糖的相对物质的量比（1．76∶1．0∶1．98）接近；糖醛酸咔唑法与该方法分析葡萄糖醛酸的含量分别为16.19%和14.85%。以上结果表明所建立的衍

生化方法及GC-MS同时定量分析多糖酸水解物中单糖和糖醛酸的方法可行。此外还对葡萄糖醛酸的质谱裂解机理进行了阐述。关键词：气相色谱-质谱联用；糖醛酸；衍生化；裂解机理；细菌多糖中图分类号：O658文献标识码：A文章编号：1000-8713（2013）01-0053-06

Simultaneousdeterminationofneutralsugarsanduronicacidconstituentsinanovelbacterialpolysaccharideusinggaschromatography-massspectrometry

WANGFengqin，YANGHangxian，WANGYizhen*（FeedScienceInstituteofZhejiangUniversity，KeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedScience，MinistryofAgriculture（EastChina），ZhejiangProvincialLaboratoryofFeedandAnimalNutrition，Hangzhou310058，China）

Abstract：Thepurifiednovelbacterialpolysaccharidewasacid-hydrolyzed，followedbythesubsequentderivatizationusingethanethiol-trifluoroaceticacidandaceticanhydride-pyridinesystemssequentially．Ourfindingsdifferfromthepreviousreportsinthattheglucuronicacidwasobtainedthrougheffectivede-rivatization．Theneutralsugarsandglucuronicacidwereanalyzedusinggaschromatography-massspec-trometry（GC-MS）withxyloseasaninternalstandard．Thepolysaccharidewasfoundtobecomposedoffucose，glucose，glucuronicacidandgalactose，withtherelativemolarratioof1．50∶1．0∶0．79∶2．06．Theneutralsugarsratiowassimilartotherelativemolarratioforfucose，glucoseandgalactoseof1．76∶1．0∶1．98throughalditolacetatesdeterminedbyGC．Thepercentagesofglucuronicacidanalyzedusingeitherthecarbazoleandsulfuricacidmethodortheabovemethodwere16.19%and14.85%，respec-tively．TheseresultsindicatethatitispracticabletousethederivatizationmethodandGC-MStoquanti-tativelyanalyzeneutralsugarsandglucuronicacidsimultaneouslyinpolysaccharide．ForGC-MSanaly-sis，theprocedurewasdevelopedforthesimultaneousdeterminationofthederivativesin25min，andwasperformedusinganHP-5MScolumn．Molecularionpeakswereobservedintheelectronionization（EI）massspectra．Thefragmentationmechanismforglucuronicacidderivativeisdiscussedindetail．Keywords：gaschromatography-massspectrometry（GC-MS）；uronicacid；derivatization；fragmenta-色谱第31卷tionmechanism；bacterialpolysaccharide在多糖的结构研究中，单糖组成分析是必不可少的环节。常见的单糖分析方法有柱前衍生化高效液相色谱法（HPLC）［1－3］，主要的衍生化试剂有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）［4，5］、1-（2-萘基）-3-甲基-5-吡唑啉酮（NMP）［6］、对氨基苯甲酸（p-AM-BA）［7］。衍生化后的产物经HPLC分离、紫外检测器检测［3，5，7］。另外，采用较多的是气相色谱法（GC）。由于单糖本身没有足够的挥发性，因此必须在GC分析之前预先将其转化成易挥发、对热稳定的衍生物，常见的单糖衍生物有三甲基硅醚衍生物、糖肟三甲基硅醚衍生物、糖腈乙酸酯衍生物、糖醇乙酸酯衍生物和三氟乙酸酯衍生物等［8，9］。在这些衍生化方法中，糖醛酸不能用糖腈乙酸酯衍生化和糖醇乙酸酯衍生化［10］。Hama等［11］通过乙硫醇和氯化氢气体对多糖进行硫醇解，再通过硅烷化试剂对单糖进行衍生。Pitthard等［12］在此基础上改进，通过乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅氮烷-三甲基硅烷体系对单糖和糖醛酸进行衍生，成功利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析了植物胶中的单糖和糖醛酸。该文献同时也研究了单糖和糖醛酸的乙硫醇-乙酸酯化衍生物，但是他们认为糖醛酸不能用该方法衍生。本研究以木糖为内标，先后用乙硫醇-三氟乙酸和醋酐-吡啶体系对单糖和糖醛酸进行衍生，再采用GC-MS同时定量分析该多糖酸水解物中单糖和糖醛酸。用该方法分析岩藻糖、葡萄糖和半乳糖的含量与糖醇乙酸酯化法的测定结果吻合，而糖醛酸含量也与传统的糖醛酸咔唑法的测定结果接近。该方法避免了使用对水分十分敏感的硅醚化试剂［8］；因为对糖的硅醚化反应而言，样品的干燥和反应体系的无水环境不易控制，而少量的水分就可使其失去硅醚化反应能力。同时，本研究对糖醛酸衍生物的质谱裂解途径进行了解析。1实验部分1．1仪器与试剂WatersAlliance2695高效液相色谱系统（美国Waters公司），配Waters2414示差折光检测器和Empower3色谱工作站。Ultrahydrogel250、500、1000串联色谱柱；TraceDSQ气相色谱-质谱联用仪（美国Thermo公司）；Agilent7890A气相色谱仪（美国惠普公司），氢火焰离子化检测器（FID）；集热式恒温加热磁力搅拌器（杭州惠创仪器设备有限公司），N-EVAPTM112氮吹仪（美国OrganomationAs-

sociates公司）。木糖、岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、乙硫醇、三氟乙酸和咔唑标准品（Sigma公司）。吡啶、醋酸酐、硼氢化钠、十水合四硼酸钠、乙醇、甲醇、盐酸、氢氧化钠、二氯甲烷、氯化钠和冰醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。多糖样品：EnterobactercloacaeZ0206（Z0206）细菌由本课题组进行分离、驯化、鉴定并保存。该细菌所分泌的多糖（EPSs）为本研究所用的样品。1．2实验方法

1．2．1多糖的分离纯化

将Z0206细菌分泌多糖用酒精沉淀并烘干。称取约20g溶于80℃热水中提取约5h。用酶法结合Sevag法脱去蛋白质［13］，得到的脱蛋白质的粗多糖再经过DEAE-52纤维素柱层析分离，用水和氯化钠溶液梯度洗脱。用苯酚硫酸法检测，收集洗脱液并透析、冷冻干燥。1．2．2多糖的完全酸水解

精确称取15mg纯化多糖样品于水解管中，加入0.5mL木糖标准溶液（8g/L），再加入3.5mL三氟乙酸溶液（3mol/L），密封后放置于120℃烘箱中，水解5h［14］，用氮气吹干，备用。1．2．3单糖及糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的制备

取8g/L的单糖（4种）及葡萄糖醛酸标样各0.5mL于同一水解管中混合，于55℃水浴中加热，氮气吹干。加入2mL乙硫醇和1mL三氟乙酸，于25℃水浴中磁力搅拌25min［12］。再于55℃水浴中

加热，氮气吹干。然后加入4mL醋酐-吡啶混合物（1∶1，v/v），于55℃水浴中磁力搅拌5h［15］。溶剂

不需要浓缩，直接进样进行GC-MS分析。完全酸水解产物的衍生化方法同上。1．2．4单糖糖醇乙酸酯衍生物的制备

单糖的组成分析参考文献［16］报道的方法。按1.2.2节方法水解15mg纯化多糖样品，氮气吹干

后加入15mg硼氢化钠，再加入3mL0.1%氢氧化钠，室温下还原10h，滴入数滴冰醋酸至无气泡冒出。加入盐酸-甲醇（1∶100，v/v）反复氮吹。再加入4mL醋酐-吡啶混合物（1∶1，v/v），于55℃水浴中磁力搅拌5h［15］。溶剂不需要浓缩，直接进样进

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