云南大学学报(自然科学版),2003,25(增刊):217～219CN53-1045/N ISSN0258-7971
JournalofYunnanUniversity
Ξ毒品苯环利啶(PCP)单克隆抗体的制备及鉴定
马 涛,吕 琦,马 岚(云南大学单克隆抗体工程技术中心,云南昆明 650091)
摘要:将毒品苯环利啶(PCP)与牛血清白蛋白(BSA)偶联形成复合抗原免疫Balb/c小鼠,获得6株稳定分泌抗PCP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.它们的腹水效价在1∶105～1∶10
6
.抗体类型鉴定结果表明,属
于IgG1,κ型.这些抗PCP单抗均可用于毒品的免疫检测.
关键词:毒品;苯环利啶;单克隆抗体;酶联免疫吸附测定中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2003)S-0217-03
苯环利啶(Phencyclidine,PCP)是毒品中的一种,被归为具有致幻作用的神经活性药物.在欧美、亚洲年轻的吸毒者中甚为流行,被称为“天使粉”.该致幻剂能影响中枢神经系统,引起感觉和情绪上的变化,导致自我歪曲和思维分裂,使人脱离现实,有时还可能引起精神病行为[1,2],严重影响人们的身体健康和生命安全.毒品问题一直是危及全球人类的、亟待解决的严重社会问题[3].人们在呼吁严打重治贬卖毒品者的同时,迫切需要解决现场快速检测毒品的问题.利用毒品和毒品代谢物的抗体来检测吸毒者尿液中的抗原物质(毒品和毒品代谢物)是毒品检测中较为常用的免疫检测方法,其中免疫层析检测试纸是目前新兴的、可方便快速准确地检测毒品的方法.而应用单克隆技术获取抗体是研制免疫层析检测试纸的关键.由于PCP分子较小,不易引起小鼠产生相应的体液免疫学反应,本研究以PCP与牛血清白蛋白(BSA)共价连接的结合蛋白PCP-BSA为免疫原,通过免疫Balb/c小鼠,用聚乙二醇细胞融合法获得了6株稳定分泌抗PCP单抗的杂交瘤细胞株,并对其进行了鉴定.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞和实验动物 NS-1骨髓瘤细胞,自本实验室.Balb/c小鼠,自北京实验动物中心.
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基和小牛血清FBCS(Hyclone);HAT和HT(Gibco);聚乙二醇PEG(Fluka);Goat-anti-mIgG-HRP(Pierce);PCP-BSA(Arista);抗体亚类检测试剂盒(晶美生物技术有限公司).
1.1.3 主要设备 酶标仪(TECAN);CO2培养
箱;紫外分光光度计(Beckman,Du640).
1.2 方法1.2.1 小鼠免疫 取4～6周龄的Balb/c小鼠,以PCP-BSA进行免疫,皮下多点基础免疫2次,
免疫剂量为50μg/只,8d后鼠尾取血进行免疫效果的检测,2周后,脾内注射法进行加强免疫,免疫剂量为100μg/只.
1.2.2 细胞融合、筛选与克隆 取免疫效果好的小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞以5∶1的比例按常规方法[2]进行融合.HAT选择培养基进行筛选,
待克隆生长增殖至1/3或1/2孔时,进行抗体检测,即ELISA检测培养上清中是否含有所需的特异抗体存在,确定杂交瘤细胞的阳性克隆情况.确定了阳性克隆后,按常规方法进行扩增和冻存.然后选取阳性值较高的细胞克隆进行有限稀释法单克隆化培养.
1.2.3 单抗效价测定 采用间接ELISA法测定.即以BSA-PCP复合抗原包被酶标板,并设空白对照,37℃包被过夜,0.05%Tween-20的磷酸盐
Ξ收稿日期:2003-03-02
作者简介:马 涛(1972- ),女,云南人,回族,硕士生,主要从事生物技术方面的研究.缓冲液(PBS-T)洗5次.用1%BSA-PBS-T37℃封闭2h,PBS-T洗5次.加入待测样,以封闭液梯度稀释(10-1～10-8),并设空白、阴性、阳性对照孔,37℃孵育1h,PBS-T洗5次.加入抗鼠IgG酶标二抗,37℃孵育1h.PBS-T洗5次,d2H2O洗3次.OPD-H2O2底物显色系统显色5～10min,测定OD值.1.2.4 单抗类别鉴定 采用间接ELISA法测定.二抗分别为抗鼠IgG酶标抗体和抗鼠IgM和IgA酶标抗体.其余操作同上述1.2.3.1.2.5 杂交瘤细胞株的染色体分析 按常规方法[4]进行.1.2.6 小鼠腹水的制备 选取10周龄的BALB/C鼠,腹腔注射石蜡油,剂量为0.5mL/只.7～10d后腹腔注射已克隆化的阳性杂交瘤细胞,数量为1.15×106～1.3×106/只;接种细胞7～10d后抽取腹水,每隔2d放取1次,直至小鼠死亡;所收集的腹水1000r/min离心10min,收集上清,检测抗体效价,并于-20℃保存备用.
2 结 果2.1 小鼠血清抗体效价检测 检测结果见表1.从表1的结果可知,2只免疫鼠的血清抗体效价都达到了10
-6
,说明免疫效果较好.
2.2 杂交瘤细胞株的建立 用PCP-BSA免疫鼠进行细胞融合,融合率为11%,用间接ELISA
筛选,取OD值高的阳性孔细胞进行2次有限稀释,阳性率达100%,获得了6株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(1B2a1,1D5a2,2H8a2,3G3a
2,6F12a1,6F12a2).2.3 细胞克隆化培养过程中细胞上清的ELISA检测 检测结果见表2.
表1 免疫小鼠血清抗体效价Tab.1Anti-PCPantibodytitersofserafromimmunizedmice
免疫鼠血清抗体效价10-110-210-310-410-510-610-710-81++++++--2++++++--
表2 ELISA检测培养细胞上清中PCP抗体滴度Tab.2Anti-PCPantibodytitersofsupernatantsfromculturedcelllinesbyELISA
母细胞株OD值一次克隆化细胞株OD值二次克隆化细胞株OD值
1B21.5721B2-5E81.6431B2a12.1671D51.6131D5-6B111.6221D5a21.7122H81.3752H8-14C81.7272H8a21.7473G31.5393G3-42A121.8053G3a21.985
6F121.6536F12-23C61.8986F12a11.9326F12a21.966
由上表可知,最终所获得的6株杂交瘤细胞株的OD值都在1.7以上,说明其分泌抗体的能力较强,在克隆化培养过程中,其OD值都呈稳定升高趋势,说明细胞株分泌抗体的稳定性良好.2.4 核型分析结果 其结果见图1.其结果表明,杂交瘤细胞的染色体众数在90～97条之间,在NS-1(54～64条)骨髓瘤细胞染色体数和脾细胞(40条)染色体数之和的范围内,说明杂交瘤细胞
株具有稳定分泌抗体的能力.
2.5 单抗类型的鉴定 按标准方法进行间接
812云南大学学报(自然科学版) 第25卷ELISA检测,6株单抗类型均为IgG1,κ型.2.6 腹水收获情况 其结果见表3.图1 6株杂交瘤细胞株核型分析Fig.1Karyotypesof6hybridomacelllines 结果显示,所获得的6株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白,且抗体效价均在10-5以上.表3 收获腹水的蛋白质量浓度及抗体效价Tab.3Proteinconcentrationsandantibodytitersofacsites杂交瘤细胞株腹水蛋白质量浓度/(mg・mL-1)腹水抗体效价 1B2a131.4010-51D5a226.5510-52H8a228.5310-5～10-63G3a228.5610-56F12a125.4410-5～10-66F12a225.3910-53 讨 论毒品检验是刑事科学技术的重要组成部分,是揭露和证实贩毒等毒品犯罪行为的重要技术手段.具有十分重要的情报作用[5].自上世纪70年代以来,国外连续报道了许多毒品检测方法,其中以理化检测法居多,包括薄层层析法,气相色谱法、气-质联用法、红外分光光度法以及高效液相色谱法等,这些方法主要用于尿液样本中毒品及其代谢物的鉴定,具有简便、快速、准确等特点,但需要依赖一些价格昂贵的检测仪[6]. 免疫学检测是毒品检测的另一发展方向.毒品免疫检测已经历了3个发展阶段[6],酶联免疫吸附法是第1代免疫检测法,检测时步骤冗长,试剂繁多,操作很不方便,且实验的重复性较差.上世纪80年代末,第2代免疫检测法(渗滤法)开始走向市场,它以免疫斑点印渍法(Dotimmunoblotting,
DIB)为原理,用印渍纸代替96孔酶标板,该法灵敏度和特异性与ELISA相似,但抗体用量少(只需几微升),操作较简便、快速,但仍存在着需附加几种试剂的不足.随着免疫学方法的快速发展和更新换代,如今免疫检测技术的应用已可不依赖于任何仪器设备,达到简便价廉、准确快速,甚至家庭自测的诊断目标.第3代毒品免疫检测法———免疫层析检测试纸便是以此为目标诞生的.它应用胶体金法,
将免疫亲合技术、印渍术和薄层层析技术相结合.
使用时,只需将试条下端直接插入样本溶液中,2～5min即可判断结果,可以说是目前最简易、快速的检测方法.
无论是哪种免疫检测法,都需获得性质均一,
稳定的单抗.我们所获得的6株杂交瘤细胞,经染色体分析和ELISA鉴定,均具有稳定分泌抗PCP
单抗的能力,由它们所制备的腹水均可收获较高质量浓度的蛋白(25～31mg/mL),而且抗体效价都较高,为10-5以上.通过纯化,应完全能满足上述免疫检测的需要.结合本试验室拥有的金标技术,
将可进行毒品检测试纸条的研制和生产.
参考文献:
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