方法一：
LB培养基、平板保存的工程菌HB101/pJJ－rhIFNα2B、Amp、酵母提取物、蛋白胨、
10×SAE、100×MgCl2、100×TES、Tris、HCl
10×SAE配方(1L)：
KH2PO410g、K2HPO4·3H2O52.4g、NH4Cl10g、K2SO426g
100L
【步骤】
种子制备：
1、取100mLLB培养基加入到一无菌的500ml三角形中，同时加入100μl100mg/ml的Amp。

2、接种甘油管保存的工程菌HB101/pJJ/rhIFNα-2b100μl，使工程菌分散于培养液中。

3、盖好试管，在摇床上以220rpm的速度，于37℃培养至对数中期（约5小时）
上罐准备：
1、配置500ml10×SAE
2、配置发酵培养基(3L)
称取胰蛋白胨30g，酵母提取物90g，加入2.64L去离子水，搅拌溶解后加入300ml 10×SAE、30ml100×MgCl2、30ml100×TES。

3、将培养基加入到5L发酵罐，插入pH、溶氧电极和温度探头，装上空气过滤膜，包扎好后放入灭菌锅中，同时放入一瓶250ml30%磷酸（调pH用），于1.05kg/cm2高压下蒸汽灭菌30min。

4、待灭菌结束后，将发酵罐放在冷却底座上，开启发酵罐控制系统，联接好冷凝水、空气线路。

5、控制pH=7.4，在转速650r/m、通气量3L/min 定D.O.为100％于自动控制发酵罐上37℃发酵22小时。

6、当培养基温度冷却到37℃后，接入制备好的种子
7、从接种完时刻起，每两小时取适当量样品，其中取1ml用于测菌体浓度（A600nm）；另取1ml加入到一称过重ep管中，12000rpm离心，小心取出900μl上清用作测菌体浓度的空白，甩干后再次称重，计算菌体湿重，按每8.3mg菌体湿重加入300μL水重悬菌体，冻于-20℃备用。

并记录发酵罐上溶氧、pH、温度等参数以了解工程菌的生长状态。

8、SDS－PAGE检测不同时间rhIFNα2B的表达情况。

9、发酵终了，收集发酵液，8000rpm离心10min，回收菌体。

10、用1.2L去离子水重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清
11、再用600mlTE重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清,得到菌体-20℃保存
方法二：
2.1种子培养基的配制
LBA：（Tryptone蛋白胨10g ＋Yeast Extr+acts酵母粉5g ＋NaCl 5g ＋双蒸水1L）∕L （NaOH调节PH至7.0）高压蒸气灭菌，压力：0.14Mpa 温度121℃时间：20min，用前加卡那霉素至50μg/ml。

LBA平板：加入2%琼脂粉，其余同上。

2.2生产菌种的制备
2.2.1琼脂培养基菌种的制备
从－80℃的冰箱中取出甘油种子管，在超净工作台中划LBA平板，37℃培养箱中培养过夜。

2.2.2一级种子液制备
从LBA平板中挑取单菌落，在超净工作台上接种于约60ml LBA培养液中，与摇床上37℃，180rpm，生长16h，OD600值约为3.0。

2.2.3二级种子液制备
将60ml一级种子液接种于3L LBA 培养液中，于摇床上37℃，180rpm，生长12h，OD600值约为3.0。

3.发酵
3.1 发酵培养基的制备
发酵培养基：于培养基配制桶中配制发酵培养基（Trytone 20g ＋Yeast extract 10g ＋KH2PO4 3g ＋葡萄糖10g）∕L（NaOH调节PH至7.4）60L，用搅拌器搅拌均匀。

用前加用前加卡那霉素至50μg/ml。

补料：（25％葡萄糖8L 、25％Yeast8L）
3.2 发酵罐灭菌及电极校正
3.2.1 高压灭菌
A．空罐灭菌：清洗发酵罐，加入20L注射用水，通入蒸气1kg/cm2 ,进行空罐灭菌，温度达到121℃，保持30min。

B. 实罐灭菌：排空发酵罐，加入发酵培养基60L，安装好各探头和各管路，通入蒸气1kg/cm2 ,进行实罐灭菌，温度达到121℃，保持30min。

C．补料灭菌25％Yeast 8L，高压蒸气灭菌，温度121℃时间：20min。

25％葡萄糖8L，高压蒸气灭菌，温度115℃时间：30min。

临用前在超净工作台上混合。

D：酸碱调节液的灭菌30％的氨水和30％磷酸
把各1L的注射用水高压蒸气灭菌，温度121℃时间：20min，临用前在超净工作台上把氨水和磷酸倒入。

3.2.2 溶氧电极和PH电极校正
A．溶氧电极校正：用饱和亚硫酸钠校正溶氧为0，实罐灭菌后，发酵罐温度设定为37℃，转速100rpm，搅拌后，临接种前按DO电极校正程序，将此时DO值设定为100％。

B．PH电极的校正：用PH为6.86和4.00的标准溶液校正。

3.3 接种
向培养基中加卡那霉素至50ug/ml ，将种子液3L，接种于发酵罐中，打开搅拌，通入空气和冷却水，开始发酵。

3.4 发酵条件设定
开始发酵温度37℃，PH 6.9，DO 40％，以30％的氨水和30％磷酸调节PH，以DO值为控制指标，DO值下降时加大转速。

3.5发酵过程监测
从上罐开始，每间隔1h从罐中取样3ml检测OD600观察并记录温度、pH、DO、转速、通气量等数据，维持pH、温度、DO稳定。

3.6补料
补料液为25％葡萄糖和25％Yeast ，当OD600值达到5左右时开始补料，补料速度根据蠕动泵的流速设定步进周期，在5个小时内把16L的培养基补加结束。

3.7 诱导表达
当OD600达到12-15时，降温到30℃,维持十分钟后加入IPTG诱导,浓度至0.5mmol/L。

3.8 收获菌体
诱导4h后，当溶氧持续上升时此时OD600大概为45，停止发酵。

下罐，收集菌液80L 左右。

用大容量离心机8000g，离心收集湿菌体称重。

并以PH为7.2的0.15M的PBS 20L 洗涤一遍, 洗涤后用大容量离心机离心收集菌体称重,约2.5kg。

取样进行SDS-PAGE电泳检查，合格菌体置于菌体收集容器冻存于冰柜。