研究报告中国酿造2018年第37卷第4期总第314期 ’93’
植物乳杆菌生物合成苯乳酸条件优化研究
李明华S孟秀梅w
(1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安223003;2.江苏食品加工工程技术研究开发中心，江苏淮安223003)
摘要：以苯丙酮酸为底物，以植物乳杆菌静息细胞为催化剂，对苯乳酸生物合成条件进行了优化。试验首先确定了不同因素对苯 乳酸产量的影响，然后通过正交试验优化了最佳合成条件。结果表明，细胞培养时间为18 h时催化活性最高，且在温度为35 T；，pH 为6.5,静息细胞、苯丙酮酸和葡萄糖质量浓度分别为80 g/L、3.0 g/L和4.0 g/L的催化条件下，经过4 h转化，苯乳酸产量达到最高，为 1.68 g/L。在最优条件下，静息细胞重复利用4次，苯乳酸产量没有显著降低，表现出了植物乳杆菌转化苯丙酮酸合成苯乳酸的良好稳
定性。关键词:植物乳杆菌;苯乳酸;静息细胞;优化中图分类号：Q939.11 文章编号：0254-5071 (2018)04-0093-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2018.04.018
Optimization of bioconversion conditions for phenyllactic acid production by Lactobacillus plantarum
LI Minghua1, MENG Xiumei1,2
(J.Jian^g^su Food and Pharmaceutical Science College, Huai'an 223003, China;2.Jiangsu Engineering Research and Department Center for Food Processing，Huai'an 223003, China)
Abstract： Phenyllactic acid (PLA) was produced i^om phenylpyruvic acid (PPA) as substrate with resting cells of Lactobacillus plantarum as catalyst. Firstly，the factors influencing PLA yield were investigated by single factor tests，and then the bioconversion conditions were optimized by orthogonal experiments. The results indicated that the cells had the highest catalytic activity after culturing for 18 h，and the optimum conditions for PLA production were as follows: temperature 35 ^，pH 6.5, and the concentrations of resting cells，PPA and glucose were 80 g/L，3.0 g/L and 4.0 g/L，respectively， and the PLA yield was the highest of 1.68 g/L after conversion for 4 h. Under these optimized conditions，after four recycles of resting cells，the PLA yield was not reduced significantly，indicating a good stability in the conversion of PPA to PLA by L. plantarum.Key words： Lactobacillus plantaium; phenyllactic acid; resting cell; optimization
苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)又被称为芦-苯乳酸或3-苯基乳酸，是一种安全、高效的生物防腐剂，能够广泛抑
制食品中致病性及腐败性微生物的生长繁殖[1]。与其他生
物防腐剂相比，苯乳酸还具有诸多优点，如易溶、易在食
品中扩散、对酸和热稳定性高等[2]，可广泛应用于食品加 工行业中。
目前，已发现多个种属的微生物可合成苯乳酸，如白
地霉[3]、丙酸菌[4]、片球菌[5-6]、芽孢杆菌[7]和乳酸菌等[8]。其中，
作为重要的益生菌，乳酸菌应用历史悠久且安全性高，已
成为合成苯乳酸的研究热点。近年来，已有多名学者应用干 酪乳杆菌(Lactobacillus casei)[9]、清酒乳杆菌(Lactobacillus saiei)间和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)[11-12]等乳酸
菌菌株发酵合成苯乳酸，产量多在2.0 g/L以下。在微生物
发酵过程中，发酵液成分复杂，产物后期提取困难，且高
浓度的底物和产物都可抑制菌体生长，最终影响到苯乳酸
产量。而静息细胞转化法是在反应体系中，以微生物细胞
作为催化剂，将外源底物进行结构修饰的一种转化方法。
收稿日期：2018-01-26 修回日期：2018-04-11基金项目：江苏省高校自然科学研究面上项目（16KJB180033)在静息细胞转化过程中，菌体不再生长繁殖，反应体系副
产物少，产物易分离纯化，且反应专一性强、转化效率高、
反应时间短，反应条件更易控制™。本研究尝试应用植物
乳杆菌静息细胞作为催化剂，转化苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，PPA)合成苯乳酸，并对其反应条件进行优化。
1材料与方法 1.1材料与试剂
1.1.1菌株及试剂植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) RF-16:分离自泡
菜中[14]，于本实验室保存；苯乳酸标准品、苯丙酮酸（分析 纯），三氟乙酸(色谱纯）：上海阿拉丁试剂公司；甲醇(色谱
纯):德国默克公司;其他主要化学试剂为市售分析纯。1.1.2培养基MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵
母膏5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，NaAc.3H〇 5.0 g/L，K2HP〇4 2.0 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，MgS〇4.7H2O 0.2 g/L，吐温-80
1 mL，MnS〇4.4H2O 0.05 g/L，pH 6.2〜6.4。在以上液体培养
作者简介:李明华(1977-),男，讲师，博士,
主要从事天然产物活性成分研究的工作。•94.2018 Vol.37 No.4Serial No.314China BrewingResearch Report
基中加入20 g/L琼脂粉即为MRS固体培养基。
1.2仪器与设备AL104电子分析天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限
公司;DNP-9052恒温培养箱:上海精宏实验设备有限公司； ZD-85A恒温振荡器:金坛科析仪器有限公司;TGL-20C高速
冷冻离心机:上海新拓公司;LC-20AB液相色谱仪：日本岛
津公司;Agilent Zorbax SB-C18 反相色谱柱(150 mmx4.6 mm,
5 pm):美国安捷伦科技公司。
1.3方法
1.3.1菌种活化
将-20 °C冰箱内保存的植物乳杆菌菌种划线接种于 MRS固体培养基平板上，30 °C培养箱内培养至长出菌落，
相同条件下转接一次，然后挑取单菌落接种于MRS液体培
养基中，30 °C、120 r/min摇床培养20 h备用。
1.3.2静息细胞制备
将活化的菌种按体积分数1%的比例接种于含200 mL MRS培养基的500 mL三角瓶中，30 °C、120 r/min摇床培养
16 h，然后于4 C、8 000 r/min条件下离心10 min，菌体用
50 mmol/L、pH6.5 的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline， PBS)洗涤两遍，即制得植物乳杆菌静息细胞。
1.3.3静息细胞转化方法
在100 mL三角瓶中，将缓冲液、苯丙酮酸和静息细胞
按一定比例配制成15 mL反应液，密封后置于恒温振荡器
中120 r/min条件下进行转化反应，反应一定时间后取样，测
定上清液中苯乳酸含量。1.3.4单因素试验
在15 mL反应体系中，分别在不同转化温度、转化pH、
静息细胞质量浓度、苯丙酮酸质量浓度、葡萄糖质量浓度
的条件下，反应一定时间后，取样测定苯乳酸含量，确定
不同因素对苯乳酸产量的影响。1.3.5正交试验
在单因素试验的基础上，以静息细胞质量浓度、苯丙
酮酸质量浓度、葡萄糖浓度和转化时间为考察因素，以苯 乳酸产量为考察指标，设计4因素3水平正交试验，因素与
水平如表1所示。
表1苯乳酸转化条件优化正交试验因素与水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for transformation conditions optimization of phenyllactic acid
水平A静息细胞质量B苯丙酮酸质量 浓度Kg*L-1) 浓度Kg*L-1)C葡萄糖质量 浓度Kg*L-1)D转化时间/ h
1602.04.032803.08.0431004.012.05
1.3.6苯乳酸含量测定方法
按照参考文献[15]，流动相A、B分别为0.05%的三氟乙酸甲醇溶液和0.05%的三氟乙酸水溶液。样品按如下程
序洗脱:0〜20爪^，流动相八10%〜100%，20〜23爪论保
持100%; 24〜25 min，流动相A 100%〜10%。流动相流速
1.0 mL/min，检测波长210 nm，柱温30 C，样品上样量10 ^L。 2结果与分析
2.1不同因素对苯乳酸产量的影响
2.1.1不同菌龄对苯乳酸产量的影响
静息细胞生物转化在本质上为酶催化的生化反应，细
胞内相应酶的含量和活性直接影响产物的产量。因菌体在 不同生长阶段相应酶的表达水平差别较大，因此首先要确 定不同菌龄细胞的催化活性。在静息细胞质量浓度100 g/L、
底物质量浓度4.0 g/L、pH6.5的反应体系中，于120 r/min、
35 °C的条件下摇床转化6 h，苯乳酸产量如图1所示。
图1菌龄对苯乳酸产量的影响 Fig. 1 Effect of bacterial age on phenyllactic acid yield
由图1可知，在菌体培养至15〜20 h时，苯乳酸产量达
到最高，说明该段菌龄细胞内乳酸脱氢酶活性最大，考虑 到菌株RF-16在培养至16 h时达到稳定期[14]，细胞得率最
高，因此后续试验均采用菌龄为16 h的静息细胞进行催化。
2.1.2静息细胞浓度对苯乳酸产量的影响
图2静息细胞质量浓度对苯乳酸产量的影响 Fig. 2 Effect of cell concentration on phenyllactic acid yield
在酶催化反应中，产物产量除了与酶活性相关外，与
酶的浓度也有直接关系。在静息细胞反应体系内，细胞浓 度决定了酶的浓度。由图2可知，
随着静息细胞质量浓度的