亚硝酸根对厌氧氨氧化过程的抑制作用

摘要：在过去十年中有关亚硝酸盐对厌氧氨氧化细菌活性的抑制作用的报道层出不穷。尽管不良效果是明显的，相关矛盾报道的分歧在于发生反应的条件和发生的反应是否可逆。对环境因素影响进行评价的同时，关于亚硝酸盐的抑制作用也做了深入研究。厌氧氨氧化活性是厌氧氨氧化颗粒在连续标准化测压批量测试监测得到的，由滞后次数，测试中最大转换率和底物/产物转化比三个要素估算得出的。这种颗粒是在一级厌氧氨氧化反应器中获得的，占优势的厌氧氨氧化生物体属于Brocadia类型。观测到亚硝酸盐抑制50%活性时浓度为0.4g

N /L.在亚硝酸盐全部去除时厌氧氨氧化活性可以恢复。使新鲜的介质保持6g N /L的浓度达到24小时，就会损失60%的活性。在亚硝酸根（0.2g N /L）暴露中使得活性大量降低由于铵根的存在。亚硝酸根产生的过程中氧的存在也会导致最大活性降低32%。由于暴露后恢复的现象表示：亚硝酸盐的不利影响是可逆的，某种程度上只是抑制作用而不是有毒的性质。在三个不同的PH值暴露之间的异同表明，亚硝酸盐是实际的抑制化合物，而不是亚硝酸。

1、 介绍

厌氧氨氧化（anammox）工艺是处理富铵废水中较为经济的脱氮工艺。在世界范围内迅速地得到推广。负责微生物生长的铵根以硝酸盐作为电子受体反应后有氮气产生。厌氧自养微生物节约了曝气时消耗的能源，也不需要有机碳的注入并且只产生少量污泥。在进行厌氧氨氧化过程中的细菌类属“Brocadiales”中的浮霉状菌目，其中污水处理最相关的两个菌种为Brocadia和Kuenenia。

在厌氧氨氧化过程中最关键的环节之一就是亚硝酸盐的稳定，因为它是整个过程中的电子受体并且由厌氧氨氧化菌完成转换，而且还是一个潜在的抑制化合物。亚硝酸盐的浓度低到5—40 mgN/L时抑制作用最强、Strouset首次提出亚硝酸盐的不利影响，他发现在100mgN/L时亚硝酸盐的抑制作用是完全可逆的。其他作者提出了抑制厌氧氨氧化过程中亚硝酸盐的浓度都类似于100mgN/L，但是并没有明确指出抑制作用是可逆还是不可逆的。一些文献提出了最高的没有抑制厌氧氨氧化活性时亚硝酸盐的浓度值（毒性阈值超过300mgN/L）。

关于亚硝酸盐的研究观察，其观察范围宽泛，基于厌氧氨氧化技术原理使得它很难预测，模拟或设计。因此，进行着亚硝酸盐对厌氧氨氧化细菌抑制作用的深入研究。特别强调了暴露于亚硝酸盐之后，厌氧氨氧化菌的复苏现象。我们区分抑制作用和毒性作用这两个概念时，抑制作用定义是一个现象，它是可逆的，并且取决于其接触抑制化合物的时间和浓度，毒性作用被定义为失去活性的不可逆过程，取决于其接触毒物的时间和浓度。

Dapena-More首先提出使用标准化测压批量测试，这种方法逐渐被修改，使其提高准确性和稳定性，并且把它作为重现我们研究的方法。最高转换率的标准评价由评估滞后次数和底物/产物转换率共同决定。

2、 材料和方法

2.1.测压试验设备 实验在配备着测压传感器的密闭瓶中进行，该测压传感器包括360数据点数据存储系统。该系统以前就用于评价厌氧氨氧化的活性。测压装置由340毫升小瓶组成，这些小瓶提供了压力传感器测量头（灵敏度级别在1百帕）。每一个小瓶有两个侧孔由可刺穿的橡胶隔膜封闭着，这两个侧孔分别用于底物注射和抽样。

2.2.生物质能的起源

生物质能的最先使用源于Dokhaven-Sluisjesdijk污水处理厂中全规模厌氧氨氧化反应器。这个反应器包含了厌氧氨氧化颗粒污泥和在SHARON反应器中部分亚硝化反应处理后的水。颗粒尺寸分布主要借助于图像分析的方法，得出94%的颗粒直径都在1.1±0.2mm范围内。实验期间，厌氧氨氧化反应器在 7.1 kg N /

m³.d的设计容积负荷下运行。2010年期间反应器的平均运行条件为:温度在34±2.5℃，PH值在7.2±0.4，污水中氮的含量分别为氨氮50±20 mg/L,亚硝氮为15±15 mg/L，硝态氮为95±20 mg/L。由荧光原位杂交技术（FISH）测定出生物质由“Brocadia”浓缩形成，污泥与AMX820探针杂交，而不是与KST157探针杂交。

2.3.测压试验的一般程序

颗粒污泥样本在无充气条件下运送至实验室（运送时间为30分钟），直接用于实验测试。生物质存在于被冲刷并重新悬浮的洗涤介质中：该介质包含微量元素用来避免养分的限制，并且该微量元素存在于25毫摩HEPES的缓冲液中。介质的PH值应用0.1摩尔/升的氢氧化钠或者硫酸调节到7.5。在此之后，液体上部空间（200 mL）应喷入氮气以便维持缺氧条件。瓶子被放置在恒温摇床上，在170rpm和30℃条件下，使顶压温度保持稳定（可升高温度使其产生变化）。当超压时自动泄压（通过插入一根针连接到一个装满水的容器作为水锁）并且注入底物基板。注入的溶液是由亚硝酸钠，硫酸铵和碳酸氢铵溶于超纯水中形成，并且该溶液要高温高压灭菌。在没有附加说明时，初始的铵根和亚硝酸根浓度应该为50mgN/L。为了避免无机碳限制反应进程同时考虑到在反应达到平衡时部分无机碳会挥发到顶空，最初的碳酸盐浓度应为32.7 mg/L。顶空氮气的生产和积累造成的压力增加，使得在整个测试过程中测量和后续处理记录自动进行。一旦压力达到一个恒定值（假定所有亚硝酸盐都要转换），液体样品进行化学分析（PH值。氨氮，亚硝酸盐和硝酸）。

2.4.初步测试

在测量最大厌氧氨氧化活性（MSAA）的初步分析时，为了保证该方法的准确性和可靠性，数据都要根据par.2.3一式两份。不同批次的生物量在整个实验期内进行相同测试运行，排除任何影响生物量组成的变化在全规模反应器中。

■ 氨和亚硝酸盐水平：铵盐的起始浓度为40,50,60,70和80 mg N/L，亚硝酸根的起始浓度待测。最初的生物量浓度为1.0 g VSS/L。这个测试也可以用来评估氮的平衡。

■ 生物量水平：在铵盐为40 mg N/L，亚硝酸盐40 mg N/L的测试中应用不同的生物量标准（0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0 g

VSS/L）；在铵盐为60 mg N/L，亚硝酸盐60 mg N/L的测试中也应用上述的生物量标准。

■ 缓冲溶液的影响：生物量悬浮在5.3毫摩每升的磷酸盐缓冲液以及HEPES（25毫摩每升）的缓冲区或非缓冲介质中（培养基组成的其余部分按上述标准配制）。实验数据一式三份。

2.5.亚硝酸盐暴露试验后的厌氧氨氧化活性

当暴露（潜在）抑制化合物测试之前，试验过程在par.2.3在中描述，具体步骤是使单一组分硝酸盐（亚硝酸钠）或多组分的铵盐（硫酸铵和亚硝酸盐）暴露1或24小时，随后进行洗涤（Fig.1,步骤A）。对氨和亚硝酸盐的毒性进行测试，在接触介质中测试氨氮和亚硝酸盐的摩尔氮浓度。硝酸钠添加到曝光控制监测介质中（未曝光生物量），硝酸钠浓度为70 mg /L以避免硫酸盐发生还原反应。

在这些测试中所使用的步骤方法如图1所示（步骤A），包括以下几个阶段：

i） 缺氧条件下暴露在不同浓度毒物中1,2或24小时

ii）取样时测定PH值，然后测定氨氮，亚硝酸盐和硝酸盐含量

iii）在清洗介质中清洗悬浮生物质

iv）通过喷射获得缺氧条件，调节压力容器和恒温摇床（170rpm 和

30℃）

v）等待约60分钟，用一根针插入浸在水中的氯丁橡胶管内，以便维持压力稳定

vi）注射一定剂量的铵盐，亚硝酸盐和无机碳浓缩液（步骤见前面相关段落） vii）第二底物浓度（只有明确表示执行程序：见前面段落）

viii）化学分析取样

2.6.亚硝酸盐抑制试验

测试亚硝酸盐在厌氧氨氧化活性的抑制作用按照步骤B进行（改编于步骤A，见图1）。

在洗涤介质中存在的生物量（见前面段落），在洗涤介质中还含有铵盐浓度为85 mg N/L（例如碳酸氢氨）。压力平衡后，压力逐渐降低，注入0.5-4毫升硝酸钠溶液以实现所需的起始浓度（见表1），测压试验开始。测压试验控制包括铵盐 50 mg N/L和亚硝酸盐 50 mg

N/L。

2.7.暴露后的长期效应

亚硝酸盐暴露后，评估连续注射无毒的氨和亚硝酸盐水平的影响，试验执行了步骤A的拓展步骤（步骤C），暴露在亚硝酸盐1000 mg

N/L中24小时。控制实验是由两个标准测压试验组成，没有毒性测试。该方法要重复进行4次。此外，测压测量发生在曝光阶段（24小时长期测压测试；所谓曝光相面值见par 3.4）。悬浮介质中也含有碳酸氢铵0.1 g N/L。把浓缩的亚硝酸盐溶液（在Milli-Q中溶解亚硝酸钠溶液）注入压力容器中，保证初始亚硝酸盐浓度为1g N/L。洗涤后，生物量悬浮于悬浮介质中，脱气，用以去除氧气并且连续注射五个梯度的浓度（称为1-5批次在par3.4;初始的铵盐和亚硝酸盐浓度高达50

mg N/L）。在2小时的毒形暴露之后，进行洗涤后的首次测压试验。在进行毒性暴露24小时后，随后分别在8,23,27,94小时进行测压试验。

2.8．亚硝酸盐抑制试验条件

抑制相关的测试，要么测试暴光后亚硝酸盐的快速影响（如亚硝酸钠），要么测试曝光后的铵盐的影响（如硫酸铵）和设计时间如上文描述。概述测试条件如表1所示。

2.9. 计算

2.9.1该方法的准确度

该方法计算总氮量平衡的相对误差时，同时考虑液相和气相（参考网上其他材料）。

2.9.2最大厌氧氨氧化活性和活性百分比

从记录的压力随时间增加的数据中，最大的氮气产率计算（参考网上其他材料）。区分所观察到的在瓶子中的生物量值，计算最大特定厌氧氨氧化活性并用氮气中氮的含量表示（单位为g /(g VSS）.d。图2显示了一个典型的测压试验，该图中所显示的数据是从初步测试数据报告得出的。曝光后活性百分比维持在一个恒定的值，计算抑制化合物方面检测量的平均值（未曝光生物量）。

2.9.3 底物/产物的摩尔比和滞后期

底物的摩尔比（铵根转换为亚硝酸根）和产物（硝酸根转换为铵根）通过计算实验前后液体样本中含氮化合物的浓度（参考网上其他资料）。为了量化底物注入和产生的最大的特定厌氧氨氧化活性延迟的一个参数叫做滞后期（见图2所表示的图形计算结果；参考网上其他资料）。 2.10.分析程序

通过分光光度流动注射分析测定可溶性氮化合物（QuickChem8500系列2FIA系统，Lachat仪器，拉夫兰，科罗拉多州，美国；参考网上其他资料。根据标准方法测定TSS和VSS。

图1，通过实验程序：步骤A：暴露后测试活动；步骤B:亚硝酸盐抑制试验；步骤C：长期暴露后的长期活动*只有当明确表示才可以进行第二次测压试验。

3.结果

3.1.该方法的准确度

一个初步检测就是多次重复测量用以评估特定厌氧氨氧化活性的方法的准确性和可靠性（MSAA）。测试初始铵盐和亚硝酸盐浓度是40-80mg N/L（总氮浓度是80-160 mg N/L），这个数值的选择低于文献中所指出的，但是足以让全部的生物量在底物（亚硝酸盐）耗尽前被激活。铵盐浓度是50 mg N/L和亚硝酸盐浓度是50 mg N/L（总氮浓度是100 mg N/L），这个浓度被选为标准测压试验的初始浓度。通过十次重复试验证明出MSAA数值变化小于2%。MSAA值显示出生物量浓度的独立（0.2-4 g VSS/L）并且只显示出很小的变化值（5%）。进一