收稿日期：2017-10-20
基金项目：国家自然科学基金项目（No.31400101）；辽宁省博士启动基金项目（No.20111143）。
作者简介：王琴（1981-），女，高级工程师，主要从事森保和土壤微生物生态研究。E-mail:wqdora@163.com。rootEctomycorrhizalfungaldiversityassociaterootssofLarixkaempferi
WANGQin
（LiaoningAcademyofForestScience,Shenyang110032,China）
Abstract：ToimprovetheapplicationofmycorrhizaltechnologyinseedlingandafforestationofLarixkaempferi,ectomy-
corrhizal(ECM)fungiassociatedwithL.kaempferirootswereinvestigated.Atotalof40rootsamplesofL.kaempferi
werecollectedin2012and2013,and55ECMmorphotypesweredetectedand28ECMfungiidentifiedbasedonITSse-
quenceanalysis.OftheseECMfungi,Cenococcumgeophilumwasthemostdominantspecies,whichwasdetected
among95%samples,occupying34.8%roottips,Russulasp.3，Sebacinasp.2,Tomentellasp.1，Russulasp.2andSebaci-
nasp.1werecommonspecies,theother14specieswererarespeces.
KeyWords：Larixkaempferi;ectomycorrhizalfungi;diversity;molecularidentification2018年第1期辽宁林业科技
JournalofLiaoningForestryScience＆Technology
日本落叶松根际外生菌根真菌多样性
王琴
（辽宁省林业科学研究院，辽宁沈阳110032）
摘要：为在日本落叶松育苗和造林中科学应用外生菌根技术，研究了日本落叶松的根际外生菌
根真菌群落组成。2012年和2013年共采集了40份日本落叶松根系样本，通过形态特征检测到55
种外生菌根形态型，ITS序列分析显示共28种外生菌根真菌与日本落叶松根系共生。其中，土生空
团菌是日本落叶松根系外生菌根真菌群落的优势物种，在95%的土壤样本中均检测到，占根尖总
数的34.8%；Russulasp.3（编号），Sebacinasp.2，Tomentellasp.1，Russulasp.2和Sebacinasp.1是常见
种；其余14个分类单元是稀有种。
关键词：日本落叶松；外生菌根真菌；多样性；分子鉴定
中图分类号：S718.81文献标识码：A文章编号：1001-1714（2018）01-0017-042018№1
外生菌根（Ectomycorrhizae，ECM）是由土壤
真菌与植物根系形成的互惠共生体[1]，广泛存在
于森林生态系统中，是森林生态系统的重要组成
部分。菌根真菌一方面从植物根系获取生长所
需的碳源，同时又帮助植物从土壤中吸收N、P等
矿物营养和水分，改良土壤结构，促进植物生长，
提高宿主抗逆性。据保守估计全球约有20000
多种[2]，我国目前报道了500余种[3-4]，还有大量的
外生菌根真菌有待发现[5]。
日本落叶松Larixkaempferi原产地是日本本州岛中部山区，属温带喜冷湿树种。我国引种日
本落叶松己有100多年历史，北起黑龙江省林口
县青山林场，南至江西省庐山和四川省西高山都
有分布。日本落叶松以其适应性强、早期速生、
成材快、用途广、材质优良的优势，正成为我国荒
山绿化和营造短周期工业用材林不可替代的树
种。日本落叶松作为外来物种，引入我国后与
其共生的外生菌根真菌的种类一直没有全面的
报道。
本项目运用形态学和分子生物学方法，系统
——17开展日本落叶松的外生菌根真菌多样性研究，为
外生菌根真菌技术在日本落叶松的育苗和人工
造林中的应用提供科学指导。
1材料与方法
1.1研究研究地点地点
研究地点设在辽宁省本溪市本溪县新农村6
组日本落叶松林内（124°02′E，41°29′N）。海拔
300~450m，土壤多为山地棕壤土，土层厚度25~
40cm，坡度12°~30°，土壤pH值5.5~6.5。主要人
工林树种为日本落叶松、红松等，天然林为柞树、
花曲柳、核桃楸、水曲柳等。灌木层为榛子、胡枝
子等。研究区内日本落叶松林龄为15~40a。1.2样品采集
在日本落叶松林，分别于2012年和2013年
进行采样。在每个采样季节随机选择20株落叶
松。沿主干挖取落叶松根系来研究其外生菌根
真菌组成。土壤和根系样品装在自封袋内带回
实验室，4℃保存。2个采样日期共采集落叶松根
样40份。1.3样品处理
土样的处理参照Agerer[6]的描述。样品在自
来水中浸泡数小时后，在380µm的土样筛上清
洗，去除日本落叶松根系上的土壤颗粒及植物
残体。挑出直径小于2mm的根样，剪成长度约
2cm的根段。在EZ4HD体式显微镜（莱卡，德
国）下观察根段，并根据宏观特征将外生菌根根
尖归类。宏观形态包括外生菌根的形状、颜色、
大小；外生菌根分支末端形状，菌套表面特征和
质地以及外延菌丝、菌索和菌核等特征。
每份样本中随机选择25个根段进行外生菌
根研究，去掉老化的根尖，记录每个根段上外生
菌根根尖数目和未被侵染的根尖数目。根据形
态特征将外生菌根根尖归类，并记录各个形态型
外生菌根根尖数目。从每个形态型中挑选新鲜
的根尖（不超过3个）放到1.5mL的离心管中，－20℃
保存，用于分子实验。1.4DNA提取
DNA提取参照Gardes&Bruns[7]的方法，略有
改动。1.5PCR扩增
采用真菌通用引物ITS1F（5'-CTTGGTCAT
TTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS-4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增反应。PCR
反应的混合液总体积为50μL，反应液包括1μL
DNA模板，1×PCR缓冲液，2.0mMMgCl2，
0.2mMdNTP，15pmol引物，2.5UDNA聚合酶，
在100TMProgramableThermalPCR仪上进行扩
增。反应条件为95℃预变性5min；94℃变性
40s，50℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；
72℃延伸10min。1.6DNA序列分析
PCR产物进行测序，序列由华大基因组研究
中心有限公司测定。
用每个测得的ITS作为靶序列，在GenBank
和UNITE数据库中搜索同源序列，挑选与形态型
序列最相近的参考序列，结合系统发育分析对外
生菌根真菌进行鉴定。序列相似性大于97%的认
为是一个种[8]。1.7数据分析
本实验中用重要值表示物种的优势度。重
要值用相对频率和相对多度之和表示。相对频
率指一个种的出现次数除以所有种的次数之
和[9]。相对多度指一个种的根尖数目之和除以所
有种的根尖数目之和。定义“优势种”为在>80%
的样本（32份样本）中被检测到的外生菌根真菌；
“常见种”为>30%的样本（12份样本）中被检测到
的外生菌根真菌。
用EstimateSversion8.0[10]构建物种累积曲线。
2结果与分析
2.1日本落叶松的外生菌根侵染率和菌根真菌
的多样性
两次样本中，检测到日本落叶松的外生菌根
真菌侵染率分别为91.4%和93.1%。
从40份根样中共检测1000个根段，获得
7981个菌根根尖，根据形态归类得到55个形态
型。对这55个形态型进行ITS序列分析后得到
28个外生菌根真菌分类单元。
以28个外生菌根的ITS为靶序列，用Blast程
序在GenBank和UNITE中进行DNA碱基序列相
似性搜索，结果显示23个分类单元属于担子菌
（占总数的82.1%），5个分类单元属于子囊菌，分
属于10科11属。其中6个鉴定到种（土生空团菌
Cenococcumgeophilum，美味乳菇Lactarius
deliciosus，红菇Russulaalbidula，正红菇
R.辽宁林业科技第1期2018年
——18lepida，铁锈色毛革菌Tomentellaferruginea和蜡
毛革菌T.galzinii），其余22个鉴定到属水平（牛肝
菌属Boletus1个种，锁瑚菌属Clavulina1个种，丝
膜属Cortinarius1个种，丝盖伞属Inocybe1个种，
盘菌属Peziza2个种，红菇属Russula3个种，蜡壳
菌属Sebacina6个种，毛革菌属Tomentella5个
种，块菌属Tuber2个种）。
本研究中每份样本包含外生菌根真菌分类单元3～8个，平均5.55个。在2012年的样本中
共检测到24个外生菌根真菌分类单元，在2013
年的样本中检测到21个外生菌根真菌分类单
元。用Jackknife2估测两次采样物种的最小丰度
分别为33和32。两个采样日期的物种累计曲线
均未达到平台期，随着采样数量的增加，更多的
外生菌根物种将被检测到（图1）。
图1日本落叶松外生菌根真菌多样性累积曲线
2.2日本落叶松外生菌根真菌群落
土生空团菌是日本落叶松根系外生菌根真
菌群落的优势物种，在95%的土壤样本中均检测
到，占根尖总数的34.8%。Russulasp.3（编号），Sebacinasp.2,Tomentellasp.1，Russulasp.2和
Sebacinasp.1是常见种。14个分类单元是稀有
种（在≤10%的样本中被检测到）（图2）。
注：柱形图上的数字表示该真菌的样本数。
图2
日本落叶松外生菌根真菌种类组成王琴：日本落叶松根际外生菌根真菌多样性第1期2018年
样本数样本数
2012年
2013年相对频度相对多度19
1912
1210997
7776
666665
533
444422
22
22411
11112222
222重要值/%40
30
20
10
0
10
20
30
40
Cenococcumgeophilum
Russulasp.3
Sebacinasp.2
Tomentellasp.1
Russulasp.2
Sebacinasp.1
Tomentellasp.3
Tubersp.1
Sebacinasp.6
Tomentellasp.5
Tomentellasp.2
Russulalepida
Sebacinasp.3
Lactariusdeliciosus
Tomentellagalzinii
Sebacinasp.4
Cortinariussp.
Boletussp.
Pezizasp.2
Russulaalbidula
Tomentellasp.4
Clavulinasp.
Sebacinasp.5
Inocybesp.
Russulasp.1
Pezizasp.1
Tubersp.2
Tomentellaferruginea2012年2013年
——19