[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。õ论著õ人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析陈建锋1,高　毅2,潘明新2(1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院)

[摘要]　目的　对人骨髓间充质干细胞(HMSCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法　抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20ml,密度梯度离心法分离HMSCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-

SCs表面标记物;MMT法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果　HMSCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、UEA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HMSCs的染色体数目未发生改变。结论　密度梯度离心法可得到纯度较高的HMSCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HMSCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。[关键词]　人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养[中图分类号]　R329.2+7 [文献标识码]　A [文章编号]　1002-266X(2006)29-0001-03

IsolationandcultivationofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsinvitroandanalysisoftheirbiologicalcharacterizationsCHENJian-feng,GAOYi,PANMing-xin(401HospitalofPLA,Qingdao266071,P.R.China)

Abstract:[Objective]Toestablishasimpleandfeasiblemethodtocultureandproliferatehumanbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(HMSCs)invitroandanalyzetheirbiologicalcharacterizations.[Methods]HMSCswereisolatedbycombininggradientdensitycentrifugationwithplasticadherence.ThegrowthcurvesofHMSCsweredrawnbyMTTassay,cellphenotypesweredetectedbyflowcytometry,celldoublingtimewascaculated,andcellkaryotypesweremeasuredbyGiemsastaining.[Results]ThepositiveexpressionofcellphenotypeofHMSCsincludesCD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HLA-ABC,UEA-1,whilethenegativeexpressionofcellphenotypein-cludesCD34,CD45,HLA-DR.ThegrowthcurveofHMSCswas“S”shaped.Thecelldoublingtimeprolongedwiththepassagesincreased.ThechromosomenumberofHMSCsofpassage3and6wereboth46,sameashumanbe-ings.[Conclusion]HMSCsofhigherpuritycanbeisolatedbycombininggradientdensitycentrifugationwithplasticadherence,andmaintaincellphenotypesashumanbeings.TheproliferationabilityofHMSCsisstrongbeforepas-sage7,butdecreasesrapidlylater.ThechromosomenumberofHMSCsremainsoriginalbeforepassage6.Keywords:human;bonemarrow;mesenchymalstemcell;cellculture

骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004～2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HMSCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。1　材料与方法1.1　HMSCs的获取及培养　采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5～20ml。5ml骨髓标本中加入5ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5ml加到5mlPercoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HMSCs完全培养基10ml。待贴壁细胞达到80%～90%融合后,以1÷3的比例传代培养。1.2　HMSCs表型鉴定　取传至第3～6代HMSCs,1

山东医药2006年第46卷第29期用0.25%胰酶室温下消化10min,1500r/min离心15min,收集细胞沉淀,PBS洗涤3次,制成1×105/ml细胞数的悬液。各取1×105个细胞悬液100Ll加入荧光标记的抗体10Ll,室温下反应孵育30min,PBS洗去未标记抗体,去上清后加300LlPBS;流式细胞仪检测细胞表型,Cell-Quest软件分析结果。1.3　HMSCs生长曲线绘制　取原代和第3、5、7、9代细胞悬液,以1×104个/孔接种于96孔培养板中,加200Ll细胞培养基,37℃恒温细胞培养箱中培养。培养第0、2、4、6、8、10、12天,各代次分别取5孔进行检测。每孔分别加入5mg/mlMTT溶液20Ll,置于恒温细胞培养箱培养4h。弃培养液,加入DMSO150Ll,振荡15min裂解细胞,使沉淀物充分溶解。用酶联免疫检测仪(波长570nm)检测光密度(OD)值。以天数为横轴,OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。按公式计算倍增时间(DT)。DT=t[lg2/(lgODt-lgOD0)],OD0和ODt分别代表接种后和培养td的细胞OD值。1.4　HMSCs核型分析　取第3、6代的HMSCs,每瓶培养基内加入40Lg/ml秋水仙素1滴,37℃孵箱中孵育2.5h后吸去瓶内液体,0.25%胰蛋白酶消化,1500r/min离心8min。弃上清,加入0.075mMKCl低渗液1ml,混匀后置于37℃水浴中16min。加入1ml核型固定液,1500r/min离心8min,弃上清,加入8ml核型固定液混匀,1500r/min离心8min。弃上清,再加入8ml核型固定液混匀过夜。再次1500r/min离心8min,弃上清,加入新配制核型固定液0.5ml制成悬液,0.25%胰蛋白酶消化50s后滴片,70℃烘干4h。Giemsa染色液显带5min。应用人类染色体计算机辅助识别系统镜下随机观察细胞染色体,计数染色体条数。1.5　统计学方法　采用SPSS10.0软件。计量资料均采用x±s表示,组间差异采用完全随机设计资料的方差分析。检验水准A=0.05。2　结果2.1　细胞形态　HMSCs形态较为均一,呈大圆形,单核;培养24h后部分细胞开始贴壁生长,少量细胞呈现短梭形改变;培养48～72h贴壁细胞明显增多,以圆形和短梭形为主;传至第3代时细胞增殖迅速,几乎全部贴壁生长,以长梭形为主,体积小,核浆比大,呈明显同向性改变,漩涡状盘旋排列。2.2　表型鉴定　HMSCs中CD29阳性表达细胞比率为95.3%,CD34阳性细胞比率为1.8%,CD44阳性细胞比率为94.7%,CD45阳性细胞比率为0.8%,CD71阳性细胞比率为96.2%,CD105阳性细胞比率为96.6%,CD166阳性细胞比率为92.7%,HLA-ABC阳性细胞比率为96.3%,HLA-DR阳性细胞比率为1.1%,UEA-1阳性细胞比率为98.7%。2.3　生长情况　原代细胞接种后0～4d细胞贴壁增长,增生不活跃,为细胞潜伏期;4～10d细胞增长极为活跃,呈指数级递增,为对数增长期;此后细胞增长逐渐减缓,进入平台期,细胞生长曲线呈S形。传代后细胞潜伏期和对数生长期均相对缩短,平台期提前,细胞生长逐渐减慢。细胞传至7～9代后增生能力逐渐降低。DT随代次增加而逐渐延长。第1、3、5、7、9代HMSCs的DT值分别为3.19±0.44、4.57±0.51、5.93±1.84、6.71±1.59、6.91±2.52,细胞生长曲线见图1。2.4　核型分析　第3、6代HMSCs染色体条数均为46条,未见数目改变。

图1　不同代次HMSCs生长曲线 注:P1、P3、P5、P7、P9分别代表第1、3、5、7、9代HMSCs3　讨论Friendenstein等[1]发现在骨髓中存在能贴附塑料培养皿、呈长棱形成纤维细胞样的细胞,培养时呈克隆生长,能形成成纤维细胞样集落形成单位,这种细胞具有多向分化潜能,即BMSCs。BMSCs易与造血系细胞区分,但其缺乏特异性的表面或胞质内抗原,目前鉴别主要依赖其形态学及功能学表现[2]。骨髓基质细胞目前尚无明确的表型分类,BMSCs亦无高度特异的表面抗原。目前研究表明,BMSCs的表面表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD9、CD106、CD120a、CD124等,而不表达CD14、CD31、CD34、CD45等细胞表面抗原[3]。本研究发现,其表面表达CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC和UEA-1,而不表达CD34、CD45和HLA-DR。从HMSCs生长曲线图上可以看出,传代早期(接种后前4d)细胞生长速度较为缓慢,第4～10天,生长速度显著加快,这种现象可能与其自分泌调节2

山东医药2006年第46卷第29期