植物抗寒性及其相关基因工程研究进展 摘 要：低温是影响植物分布、产量及品质的重要非生物胁迫因素，提高植物的抗寒性是作物育种的重要任务。近年来,植物抗寒分子机理研究不断深入，植物抗寒基因工程研究获得了长足的进展。本文从膜稳定性、抗氧化酶活性、抗冻蛋白、低温信号转录因子和渗透调节物质等方面对植物耐冷性基因工程研究进展进行了分析、归纳与总结，旨在为植物抗寒机理研究及植物抗寒育种提供参考。
关键词：植物；抗寒性；基因工程；抗寒育种。 Research Advance in the Cold-resistance and the related Genetic Engineering in Plants
Abstract: Low-temperature is a abiological intimidation affecting plant's distribution、output and quality, and the breedingof cold-resistant plants is one of the most important tasks in the development of agriculture's.In recent years,plant's cold-resistant genetic engineering has acquired great progress, with the mechanism of cold- resistance is studied deeper and deeper.This paper gives a generalstatement about the recent development of plant genetic engineering for cold-resistance in composition of membrane lipids,the activity of antioxidang enzymes,the antif reeze protein,the transcription factors of lowtemperature cell signaling and osmolytes,aiming to provide some useful information and ideas to research-ers who work on plant breeding and the mechanism of cold-resistance.
Key words: plants; cold-resistance; genetic engineering; plant breeding of cold-resistance.
温度是气候因素中影响植物地理分布的主导因素，低温胁迫是植物栽培中经常遇到的一种灾害，涉及到粮食作物、园艺植物及其它许多经济植物。低温影响植物的生长代谢，引起植物相关生理指标变化，导致植物的生长受损，严重时导致死亡。 低温不仅限制植物的种植范围，也会造成减产和品质下降，严重时甚至绝收。因此，有关植物抗寒性的研究一直是植物学研究领域的热点之一。早期研究主要集中在植物遭寒害后的细胞形态结构、生理、生物化学变化等方面。对植物的抗寒分子机理认识不够，提高植物抗寒性主要依靠传统育种方法，虽然也取得一些进展，但由于其周期长且工作繁琐，已不适应现代农业的发展要求[1]。近年来，随着对植物抗寒分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗寒研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗寒基因工程的发展。 1植物抗寒生理研究进展 1.1 生物膜系统与抗寒性的关系 1973年,Lyons提出了著名的“膜脂相变”假说[2],认为温度下降时，生物膜首先发生膜脂的物相变化，从液晶相变为凝胶相，膜的外型和厚度也发生变化， 可能使膜发生收缩，出现孔道或龟裂，因而膜的透性增大，膜内可溶性物质、电解质大量向膜外渗漏，破坏细胞内外离子平衡，造成“生理干旱”和“有毒物质积累”。和生物膜系统有关的抗寒生理指标有电导率、脂肪酸不饱和度、丙二醛等。 1.2 渗透调节物质与抗寒性的关系 渗透调节是植物在逆境胁迫时出现的一种调节方式，由细胞生物合成和吸收累积某些物质来完成其调节过程。在逆境条件下，细胞内主动积累溶质来降低细胞液的渗透势，以防止细胞过度失水。渗透调节物质主要包括可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和甜菜碱等。 1.3 保护酶系统与抗寒性的关系 植物体内存在活性氧和自由基的清除保护酶系统，包括过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)以及抗坏血酸氧化酶(ASA-POD)等。正常情况下，细胞内活性氧的产生与清除处于一种动态平衡，不会引起伤害。但当处于逆境条件时，细胞自由基产生和清除的平衡遭到破坏而出现活性氧的积累，高水平的活性氧可能加剧膜脂过氧化和膜蛋白的聚合，从而破坏膜结构和功能，这种累积超过一定的阈值，就会发生膜伤害，甚至导致植物死亡。 在膜保护酶与抗寒性的研究中，以SOD的研究最多。SOD与植物多种抗逆性相联系。根据所含金属辅基的不同，可将其分为Cu,Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种类型。SOD在好氧生物体内对防御活性氧伤害起重要作用，可专一清除超氧阴离子自由基(O2-·)，将其转变成过氧化氢(H2O2)。而POD和CAT可以有效地将H2O2转变成O2，从而消除O2-·对生物体的毒害。CAT是清除H2O2的主要酶类，还可以清除线粒体电子传递、β-脂肪酸氧化及光呼吸氧化过程中产生的H2O2。 Mckersie发现植物叶绿体中SOD的超量产生可保护植物不受冷伤害。而植物组织在低温胁迫下，SOD酶活性一般是先升高后下降，表明低温诱导SOD酶活性增强[3]。所以可用SOD值下降时的温度高低作为抗寒性鉴定的标准[4,5]。研究表明，抗寒性强的桉树的SOD活性对低温的反应能力比抗寒性弱的敏感[6],山葡萄枝条中过氧化物酶活性随着低温锻炼过程中抗寒力的提高而提高，且抗寒性强的种类酶活性更高[7]。马占相思树苗的CAT活性随着温度的降低先下降然后升高，这表明其对低温有一个适应过程，随着胁迫加深，活性又下降;POD、SOD活性都随着温度下降逐渐下降，但下降幅度不大，表明CAT、POD、SOD在低温严重胁迫过程中，仍具有较高的活性，仍能清除活性氧自由基，以减少对膜的伤害[8]。马德华对黄瓜的研究则显示，低温下POD活性与耐低温能力关系密切，与对照相比，POD活性相对增加量与耐低温能力之间亦表现为正相关[9]。陈旭微对豌豆和绿豆的研究发现，低温胁迫后，抗冷性豌豆下胚轴内SOD活性极显著上升，而在冷敏感绿豆中，SOD活性一直维持在较高水平[10],这也证实了参与活性氧清除反应的第一个酶是SOD，它在抗氧化酶类中处于重要地位。此外，植物体内脱落酸(ABA)等激素的含量也与植物抗寒性有关。低温条件下，植物体内累积的ABA能对低温调控基因及RAB基因进行调控，从而提高植物的抗寒性[11]。对甘蓝和茶树抗寒力的研究均表明了ABA与抗寒力的关系[12,13]。因此，ABA是一种逆境应激激素。 2 植物抗寒基因研究现状及研究举例 2.1 膜稳定性相关基因 生物膜是植物细胞及细胞器与周围环境间的一个界面结构，它能够接受和传递环境信息，对环境胁迫做出反应.同时，生物膜对保持植物正常生命活动也具有重要的作用[14].研究表明，生物膜是低温冷害作用的首要部位，而且低温伤害 的原初反应发生在生物膜系统类脂分子的相变上[15].早在20世纪70年代，Lyons[16]就提出“膜相变的寒害"假说，认为植物正常生理活动需要液晶相的膜状态，在遭受低温伤害时生物膜首先发生膜脂的物相变化，这时膜脂从液晶相变为凝胶相，膜脂上的脂肪酸链由无序排列变为有序排列，膜结合酶的活力降低，且膜上出现孔道或龟裂，使膜的通透性增大，膜内可溶性物质大量向膜外渗透，破坏了细胞内外的离子平衡.同时膜结合酶结构改变，酶促反应速度失去平衡，导致植物细胞生理代谢变化和功能紊乱，从而使植物细胞受到伤害.许多研究表明，膜脂中的类脂和脂肪酸成分的不饱和度明显影响膜脂的相变温度.一般认为，膜脂不饱和脂肪酸含量增高，膜脂相变温度会降低，增加了膜的流动性，从而使植物的抗寒性相应提高.反之，冷敏感植物的膜脂相变可能是由于膜脂脂肪酸的不饱和程度较低，低温下膜脂由液晶相向凝胶相转变，造成细胞膜膜相分离，从而引起细胞代谢紊乱[17].近年来，应用基因工程技术导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因，通过降低脂肪酸的饱和度以提高植物抗寒性的研究，已经取得了突破性的进展[18，19].日本国立基础生物化学研究所首先利用脂肪酸去饱和酶基因进行了植物抗寒性的分子改良.1993年，High等[20]筛选了一个膜脂不饱和脂肪酸突变蓝藻(SynechocystisPCC6803)菌株fad12，并克隆了Δ12去饱和酶基因desA，研究表明desA基因的表达是由于低温首先降低了膜脂的流动性，刺激desA的转录，使膜脂不饱和度增加，从而增加膜脂的流动性. 2.2 抗冻蛋白基因 抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)是一类具有热滞效应和冰晶生长抑制效应的蛋白质，能以非线性形式降低水溶液的冰点，但对熔点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值，它们在受低温环境胁迫时能使有机体抵御冰冻环境.抗冻蛋白最早是在极地海鱼中发现的，在鱼类和昆虫类中研究比较深入，目前已有将这类基因转入植物的报道.黄永芬等[21]采用花粉管通道法及子房注射法将美洲拟鲽afp基因导入番茄，田间抗寒性实验表明，在春季平均气温低于正常年份4.4℃的条件下，转基因植株生长优于对照，致死温度也比对照降低了2℃.对植物AFP的研究较晚，1992年，加拿大Griffith等[22]首次报道从经过低温锻炼可忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了植物内源性AFP，标志着植物抗冻蛋白研究的开始，随后已从多种植物中获得具有热滞效应的AFP[23]. 2.3 低温信号转录因子 植物在遭受低温胁迫时，从感受低温信号到发生一系列生理生化反应和调节基因表达，进而产生抗寒能力，存在一个复杂的信号网络传导系统，CBF(CRT/DRE2bindingfactor)转录因子调控的信号传导途径是其中的一个传导系统，其传导途径为:CBF转录因子→CRT/DRE基序→COR基因表达→植物抗寒性增加，即转录活性因子CBF结合到CRT/DRE基序上，诱导了COR基因表达，从而提高了植物的抗寒性[24].甄伟等[25]将CBF1基因转入烟草和油菜基因组中，对转化的烟草和油菜抗寒性的检测结果显示，转基因油菜的抗寒性有明显提高，转基因烟草的抗寒性也有一定提高. 2.4 渗透调节基因 在渗透胁迫过程中，植物体内会产生一些具有保水作用的渗透调节物质来降低植物体内的水势，从而维持体内的水分平衡.这类渗透调节物质有脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖和醇类物质等.低温胁迫时，植物通过诱导渗透调节物质的生物合成酶基因的大量表达，以增加这类物质的积累，维持渗透压的平衡，从而避免低温伤害.