肿瘤实验动物模型的建立及应用研究进展 摘要：实验动物模型是人类肿瘤的复制品，可分为自发瘤模型．诱导模型、移植模型和转基因动物模型。实验动物模型与其模拟的人类肿瘤在分子、组织学以及生物学特性方面有许多共同性，可以用于肿瘤发病机制研究、肿瘤治疗药物的筛选以及肿瘤的基因治疗。本文对肿瘤实验动物模型的建立及其临床应用进展予以综述。 关键词：动物模型；筛选；基因治疗 Abstract：Lab0ratory animal model is replication of human tumors，including idiopathetic tumor model、induced tumor madel、transplanted tumor model and transgenic animal model．Laboratory animal madel is similar with human tumors it anah,gues on molecule．histulngical anatomy and bionomics．can be used in the investigation of tumor etiopathogenesis，screening of tumor curative and tumor gene therapy．This article review about experimental animal models of tumor establishment and it’8 clinical application． Key words：Laboratory animal model；Seining；Gene therapy 实验动物模型是人类肿瘤的复制，利用动物模型可以缩短研究时间，观察肿瘤发生、发展的全过程，并可在人为控制条件下进行各种实验研究，对肿瘤的发生发展机制、预防及治疗的研究有着重要意义。现对动物肿瘤模型的类型及应用进行 综述。 1 肿瘤动物模型的类型及其建立 1．1 自发瘤模璎实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的肿瘤。自发性肿瘤动物模型最大的优点是，完全在自然条件下发生的疾病，排除了人为因素，肿瘤的发生、发展与人类肿瘤相似，反映了动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度。但以自发瘤模型作为动物模型使用的仅为少数，且存在周期长，饲养动物量大，耗资大的缺点。但动物自发瘤模型是转移瘤模型的来源之一¨一。 1．2 诱导模型用致癌物在 动物一定部位或一定器官诱发出的肿瘤，在诱导模型的建立中，动物和致癌物的选择极为重要，且可以通过控制致癌物的计量来控制诱癌时间和程度。如某种肿瘤仅能在某种动物身上诱发，与动物种系和不同器官的敏感性有关，因此动物种系间差别很大。如用芳香烃类致癌物诱发皮肤癌，以小鼠最佳，而大鼠很难诱发出皮肤癌，亚硝胺类致癌物在大鼠体内可诱发食管癌，而在小鼠体内仅能诱发出前胃癌旧J。1937年，Hueper首次报道用B萘胺成功诱导犬的膀胱癌模型，现已发现许多能诱导膀胱癌的化学物质，目前较理想的致癌剂有3种：芳胺N一[4一(5一硝基-2-呋喃)2一噻唑]甲酰胺、N一丁基．N(4-羟丁基)亚硝胺和N一甲基亚硝基脲(N—methylnitrosourea，MNU)。N．丁基一N(4一羟丁基)亚硝胺的致癌性局限于大鼠、小鼠和犬的膀胱。N．丁基一N(4-羟丁基)亚硝胺的进一步代谢产物N-丁基一N一(3一羧丙基)亚硝基胺从尿中排泄，直接与尿路上皮接触，造成上皮细胞DNA的损伤，从而导致细胞癌变po。N一丁基一N(4一羟丁基)亚硝胺常溶于饮水中饲喂动物，常用浓度为0．05％L3,4]。芳胺N一[4一(5一硝基-2．呋喃)2．噻唑]甲酰胺常用于诱发C3H／He小鼠、Fischer大鼠膀胱癌∽j J，主要是鼠类动物对其敏感性高。食物中添加某些促癌物质呵缩短致癌周期，提高致癌率。但芳胺N—E4一(5．硝基-2一呋喃)2一噻唑]甲酰胺诱发动物膀胱癌有需时长、费用高的缺点。MNU属直接致癌剂，需膀胱灌注，常选用雌性6—8周龄Wister、Fischer大鼠为实验动物，以便于经尿道插管灌入MNU溶液。Kunze等旧1研究表明，MNU分次灌入膀胱内其诱癌率与MNU总量及灌人次数呈正相关，诱癌需时与MNU总剂量呈负相关。 1．3 移植模型这是目前应用最多的肿瘤模型，用肿瘤组织或细胞(源于动物或人)移植到动物体内所形成的肿瘤动物模型。根据受体动物不同移植性肿瘤模型可分为正常动物移植性肿瘤模型和免疫缺陷动物移植性肿瘤模型，包括细胞和组织块移植，按来源又可分为同种移植和异种移植。人类肿瘤移植瘤的来源有肿瘤活检组织，手术切除标本、取自肿瘤患者的胸腹水内的肿瘤细胞和人类肿瘤细胞系。建立移植瘤的基本条件是：肿瘤标本的取材应在无菌条件下取新鲜、无坏死、无包膜的瘤组织，手术标本的取材应在1～2 h内完成，移植瘤受体动物(包括免疫缺陷动物)要求在4周龄左右，移植的最常用部位是背侧皮下。1983年，Crabtree等"1报道将芳胺N一[4．(5一硝基-2一呋喃)2．噻唑]甲酰胺诱导的膀胱肿瘤细胞悬液经小鼠腹部注人膀肇肌层内也可成功制造肿瘤的原位模型；膀胱损伤后腔内灌注肿瘤细胞也是近年较常用的原位模型建立方法。用酸性液体处理膀胱造成黏膜损伤后再向膀胱内灌人AY227小鼠膀胱移行癌细胞，磁共振成像和流式分析jl!Il察到移行癌细胞肿瘤的发生率达到97％，且多数为表浅型。荷肝癌裸小鼠模型的建立则可将人肝癌细胞／组织移植于裸小鼠的肝脏：裸小鼠全麻后，无菌条件下取右上腹横切口，暴露肝脏，将人肝癌组织块植入，缝合固定于肝实质内(或用粗针头直接植入)；或用肝癌细胞悬液注射于肝包膜下实质中。由于肿瘤移植部位的血供是影响移植瘤生物学行为的一个关键因素，故原位移植模型移植成功率高。 1．4 转基因动物模型转基因动物技术是指借助 基因工程手段将特定的外源基因导人动物细胞的染色体内，使其发生整合并遗传的过程，由此培育出成功携带外源基因的动物个体，即转基因动物。成功地获得转基因动物品系应包括以下几个方面：目的基因的获得和改建，目的基因向生殖细胞或胚胎干细胞的高效转移，受精卵或胚胎组织在合适环境中的发育以及筛选鉴定稳定的品系。Zhang等捧1发现，小鼠Uroplakin基因上游一段3．6 kb长的序列能引导癌基因在尿道上皮特异性表达，他们用其诱导癌蛋白基因SV40T在移行上皮表达，并通过将该序列与SV40T融合构建出UP2SV40T嵌合基因，这种嵌合基因转染的小鼠有移行上皮癌的发生，病理报告该肿瘤在表型及转化模式上均与人移行癌细胞有高度相似性。这种肿瘤转基因模型的建立为膀胱肿瘤发生机制及治疗策略的研究提供了一个有效的途径。2002年他们一1再次利用Uroplakin基因促进尿路移行上皮高表达表皮生长因子，发现表皮生长因子受体mRNA水平高的转基因鼠出现明显的移行上皮增殖，并高表达增殖细胞核抗原，进一步发现表皮生长因子与SV40T联合转基因鼠可以使SV40T诱导的原位上皮癌发展为高度恶性膀胱肿瘤，这些证明在联合转基因模型中，表皮生长因子有协同SV40T致癌作用”1。 2 肿瘤实验动物模型的应用 2．1 肿瘤发病机制的研究在肿瘤的研究中，人们迷惑于癌基因的改变和肿瘤的发生的因果关系，动物模型技术为寻找这个问题的答案提供了一条直接而明确的途径。Quaife等¨刮用大鼠弹力蛋白酶I基因的增强子和激活的H—ra8基因组成融合基因，由此制备的转基因小鼠几乎100％发生胰腺癌。直接证明了癌基因突变是肿瘤发生的起因。Owens等¨¨应用转基因小鼠模型研究颗粒细胞瘤的发生机制，结果发现，在卵巢颗粒细胞瘤中，促黄体生成激素受体mRNA表达减少，周期性人绒毛膜促性腺激素处理可预防小鼠颗粒细胞瘤的发生。在Ot一抑制素SV40转基因小鼠中，高水平促黄体生成激素可促进卵巢颗粒细胞瘤的发生，而持续高水平促黄体生成激素还是乳腺肿瘤发生的诱因。 2．2 肿瘤治疗药物的筛选许多肿瘤高发品系的转基因小鼠可用于筛选治疗和预防肿瘤的药物。视网膜母细胞瘤基因的转基因小鼠具有明显的发生视网膜母细胞瘤的倾向，给这种小鼠腹腔注射维生素D，，不但能使该肿瘤的发生率下降和发生时间推迟，而且还能抑制已发生肿瘤的发展。Mickisch等¨副用__不完整的小鸡B一肌动蛋白启动子与多抗药转运蛋白cDNA重组，融合基因导入小鼠，获得在多种组织中表达多抗药转运蛋白的转基因小鼠品系，它具有对多种抗癌药的抗药性，可以广泛应用于研究化疗药物给药方案，控制抗癌药物的毒性，开发化疗增敏剂以提高化疗效果等方面。临床上对视网膜母细胞瘤进行化学治疗的效果尚有一定的争议，1989年White等¨纠利用视网膜母细胞瘤裸小鼠前房移植模型观察了6种化学治疗药物对视网膜母细胞瘤的治疗效果。这6种药物分别是长春新碱、环磷酰胺、放线菌素D、强力霉素、注射用亚胺醌及氮烯咪胺。结果表明，环磷酰胺在所有肿瘤中治疗效果肯定而且一致；氮烯咪胺有较小程度的差异；长春新碱、强力霉素和放线菌素D治疗效果不好，与对照组无差异；注射用亚胺醌治疗效果最好，远远超过传统的化疗药物。因此，他们认为注射用亚胺醌有望成为治疗视网膜母细胞瘤的新药。同时White等¨3J对裸小鼠视网膜母细胞瘤前房移植模型进行了半定量分级，为今后评价视网膜母细胞瘤治疗效果提供了有效的观察指标。1990年，White【141又进一步证明裸小鼠腹腔内全身应用注射用亚胺醌和局部滴眼应用注射用亚胺醌治疗效果一致，均能产生抑制肿瘤生长的作用。这些结果对于指导临床对视网膜母细胞瘤患者进行化学治疗有一定的参考价值。 2．3 肿瘤的基因治疗以肿瘤细胞为直接作用目标的治疗有可能从分子水平治疗恶性肿瘤。Nielsen等¨副以H．ras转基因小鼠为模型，观察SCH58500(ACN53)(即一种表达人p53基因的复制缺陷型重组腺病毒)与化疗药物联合应用的效果，结果发现SCH58500能增强许多化疗药物的作用。自杀基因系统是一种新型的恶性肿瘤治疗方法。阿霉素是卵巢上皮性癌化疗中常用的一线药物，但由于其较强的心脏毒性而限制了临床应用。为防止阿霉素对心脏的毒性，Dell’Acqua等¨钊建立了一种转基因小鼠模型，此种小鼠心肌能过度表达人mdrl基因，单次给予阿霉素10 mg／kg或3次累计量30 ms／kg后发现，对照组小鼠心肌均出现明显的心肌损害，而转基因小鼠则未出现明显的心肌损害。结果表明，通过基因治疗加强对心肌的保护作用，可增强阿霉素治疗的疗效及安全性。 3 结语 大量动物模型的建立使人们可以深入研究肿瘤生物学行为，如癌基因依赖性、基因组不稳定性和肿瘤微环境等。一个好的肿瘤动物模型与其模拟的人类肿瘤在分子、组织学以及生物学特性方面有许多共同性，对于深入研究肿瘤的发生、发展、预防和治疗有着极为重要的意义。 参考文献 [1] 高进，李敏民．动物肿瘤模犁及其应用[M]／／高进．肿瘤学基础及实验．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社．1992：38-87． [2]Chen T，Na Y，Wanibuchi H，et a／．Loss of hetemzygosity in(Lewisx F344)FI rat urinary bladder tumors induced with N—bu—tyl—N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine followed by dimethylarsinieacid or sodium L—ascorbate[J]．Jpn J Cancer Ros，1999，90(8)：818．823． [3]Zhang XH，Takenaka I．Morphological changes in the basementmembrane during progression from non-invasive rat bladder cancerinduced by N—butyl—N一(4-hydroxybutyl)nitrosamine[J]．Br JUrol，1997．79(3)：378-382． [4] Bohle A，Jurczok A，Ardeh P，et u1．Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in vivo[J]．J Uml，2002，167(1)：357-363． [5]Asanuma H，Arai T，Seguchi K，et a1．Successful diagnosis oforthotopic rat superficial bladder 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