量子点荧光探针合成及应用 姓名：廖晨博 学号：1141109043 摘要：量子点是近年发展起来的一种新型荧光探针，与传统的有机荧光染料相比，具有许多优良的光谱性能，在生物化学、细胞生物学、分子生物学等研究领域显示了极其广阔的应用前景，已经引起了人们越来越广泛的重视。本论文瞄准这一重要的研究方向，以量子点的制备、量子点的性能表征以及量子点在化学生物分析中的应用为主线，对当前迅速发展的量子点进行简要综述。
关键词：量子点；荧光探针；生物分析；水相合成；油相合成
1. 引言 近年来，对疾病进行早期、高灵敏度、特异性、稳定性特别是高通量诊断，已成为全世界科学家关注的热点。其中，荧光探针作为报告探针用于疾病的诊断已经越来越普遍。荧光探针具有高灵敏性和可识别性。现在常用的荧光标记，由于荧光染料分子荧光特性的限制(如：吸收谱窄、荧光光谱较宽、量子产率低、荧光易衰退等)，远远不能适用于目前对疾病的高标准检测。与传统的有机荧光染料相比，近年来发现和发展的新型荧光探针——量子点(quantum dots)，又叫做半导体纳米晶，可以解释为粒径小于或接近电子的德布罗意波长或电子平均自由程相的半导体纳米颗粒。它的直径只有1～12nm，因此存在特殊的物理性质，如量子尺寸效应、表面效应等，表现出优良的荧光纳米效应。它的激发光谱宽且连续分布、发射光谱窄而对称、发射光稳定性强．不易发生光漂白，通过改变粒子的尺寸和组成可获得从uv到近红外范围内任意点的光谱，因此相对传统有机荧光试剂具有无可比拟的优越性。其独特的光学和电学性质引起了物理学家、化学家和生物学家的浓厚兴趣和广泛关注，已经成为纳米技术的突出代表[1]。本文将重点对当前迅速发展的量子点荧光纳米颗粒进行简要综述，主要包括量子点的基本特性、制备方法、表面修饰及其在化学生物分析中的应用实例等。
2. 量子点的基本特征
2.1量子点的荧光发光原理 半导体纳米材料的光致发光主要遵循：斯托克斯定律、反斯托克斯发光、辐射跃迁和非辐射跃迁这三个规律。研究表明发光材料的发射光谱容易受到发光材料的激活离子或离子团等发光中心影响。发光材料的发光形式主要包括复合发光和分立发光中心发光两种。复合发光是指处于激发态的电子离开原来的发光中心进入高能级的导带，而在原来的能级处留下一个空穴，导带中的电子与离化中心的空穴重新复合，产生发光。与此同时电子或空穴也会在量子点的内部扩散盈[2]。分立发光中心发光则是指处于激发态的电子并不离开原来的发光中心，只是从基态被激发到一些高能量的激发态上。处于高能级导带上的电子不稳定，电子可以再跃迁回价带基础能级而发射光子；也可以落入量子点的电子陷阱中。当电子落入较深的电子陷阱中的时候，大多数电子以非辐射的形式而猝灭，只有极少数的电子以光子的形式跃迁回价带或吸收一定能量后跃迁回到导带。因此，当量子点的电子陷阱较深、较多时，其量子产率会较低[3]。 半导体量子点的电子和空穴主要通过电子和空穴直接复合发光、表面缺陷态间接复合发光、导带或价带到杂质能级复合发光和导带电子和价带空穴通过深能级复合发光四种相互竞争途径发光。若量子点的表面存在缺陷，量子点对电子和空穴的俘获能力强，电子和空穴一旦产生立即被俘获，使得电子和空穴直接复合的几率很小，从而导致激发态的发光很弱，而只有弱的表面缺陷态的发光。为了消除量子点表面缺陷提高量子产率，我们应该想方设法制备表面完整的量子点或通过修饰量子点表面来减少其表面缺陷，从而使电子和空穴能够有效地直接复合发光[4]。
2.2量子点的特征
2.2.1独特的物理化学特性 在零维的准球形量子点中，量子点内的电子在各个方向上的运动都受到限制。随着量子点尺寸的逐渐减小，量子点吸收光谱的特征峰位置和荧光光谱随之蓝移，其电子能态呈现出孤立的能级结构，从而表现出量子尺寸效应(quanturnsize effect)嘲即量子限域效应(quantum confinement effect)。同时随着量子点的粒径减小，其比表面积会随之增大，量子点表面原子数在总原子数中所占百分比也会急剧增大，从而引起量子点的性质上的变化：量子点表面原子的配位．不足、不饱和键和悬键增多，具有极高的表面活性，极容易与其它原子结合，这就是人们常说的量子点的表面效应(surface effect)。这一特性在催化方面应用广泛。 微观粒子具有的贯穿势垒的能力称为隧道效应，即当势垒能高度大于微观粒子的总能量时，该粒子仍然能贯穿这势垒 [5]。隧道效应是基本的量子现象之一。近年来研究发现一些宏观量，如量子相干器件中的磁通量、微颗粒的磁化强度等也具有隧道效应，因此隧道效应也称为宏观量子隧道效应(MOT，Macroscopic Quantum Tunneling)。量子点是纳米粒子的一种，它同样具有宏观量子隧道效应。
量子点除具有上述特性外，还具有小尺寸效应、高扩散性和极强的吸波性等理化特性。 2.2.2优良的光学性能 与传统的有机染料和荧光基团相比，量子点具有宽吸收、窄发射和随尺寸可 调的荧光特性。图1展示了常见的有机染料和CdSe／ZnS量子点的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。由图1的量子点的紫外吸收光谱可知量子点存在大量的能量态，其中最低的激发能由第一个紫外吸收峰(也称第一激子吸收峰)表示。量子点能吸收所有比它的第一激子发射波长更短的波长的光。同时量子点在更高的能级上还存在着多重电子态，因此可以用更短的波长激发量子点即其激发峰宽且呈连续分布，而常用有机染料罗丹明和德克萨斯红只能在较窄的范围内激发。科研工作者可以通过改变量子点的尺寸，实现对量子点发光特性的调控。科研者曾报道在不改变CdSe组成的情况下，仅通过改变其颗粒粒径的大小，就能够很好地控制其荧光发射范围，实现了发射荧光由蓝色到红色的调节如图2所示。另外，人们亦也可以采用不同组分的反应原料制备不同尺寸的量子点，从而获得荧光发射峰峰位置从400 nm到2 u m范围之间的荧光。量子点同时也具有窄且几近高斯对称的荧光发射光谱峰(一般半高峰宽只有40 nm)。将多色量子点应用于多通道分析检测时，由于量子点的发射峰很窄，呈现不同颜色的量子点之间不会存在相互影响，从而大大地增多分析的信息量同时也提高检测的灵敏度。这一特性在量子点的多元分析应用中实现单一光源激发的多色探测、成像和定量分析应用中将发挥重要作用[6]。这一性质解决了传统荧光染料多元应用分析中对多光源要求的难题。 与有机染料相比，量子点的另一优良的光学性能就是具有宽大的斯托克斯位移(Stokes Shift，指相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱如荧光光谱中最强波长间的差值)，若用多种不同发射频率的量子点材料同时表征分子结构时，发射峰大幅交叠现象会减少，因此量子点在用作识别生物大分子和活体细胞的荧光探针方面具有十分诱人的应用前景。
图1.CdSe／ZnS量子点(b)与荧光素等有机染料(a)吸收发射光谱比较 图2. 不同尺寸CdSe量子点的荧光图像 量子点具有十分灵活的表面可修饰性，科研工作者能十分方便地对其表面进行化学改性以适应有机或水相应用的需要。在量子点表面进行功能基团设计、修饰改造，使其能与特定的生物分子偶联，从而获得人们需要的生物荧光探针。另外，也可对量子点进行表面设计改造之后应用于光学器件、防伪材料、电子器件和激光器等领域。
3.量子点的制备 目前文献报道的量子点的制备主要包括物理和化学两大类方法。物理制备方法又可分为微影蚀刻法和分闸法。它们一般是通过机械研磨、微加工、离子束注入或者单原子操作等手段完成。化学方法主要有自组成法和化学溶胶法。其中化学溶胶法是以化学溶胶方式合成，可制作复层量子点，过程简单，且可大量生产，是目前制备量子点最主要的手段之一。化学溶胶法合成量子点通常可分为油相合成、水相合成和两相合成[7]三种合成方法，其中以油相和水相合成量子点的较多，在此重点介绍量子点的油相和水相合成方法。
3.1油相合成量子点[8] 在有机体系中合成，成本较高，操作复杂，所得产物具有较为优良的光谱性能，单分散性好，光稳定性强，一直以来都是研究的热点所在，制备方法得到了不断的成熟与完善。其中，最典型的方法由Murray 于1993年首次报道，他们采用Cd(CH3)2 和Zn(CH3)2 等金属有机化合物作为原料，将其与Se 或S 的前体溶液混合到三正辛基膦（TOP）中，然后快速注射到热的三辛基氧化膦（TOPO）溶剂中，这种快速注射使得反应物浓度突然达到过饱和，因而立即发生成核作用，得到纳米晶种，接着经过缓慢地熟化过程和退火处理，再经过尺寸选择性沉淀和离心，即可得到表面被溶剂分子钝化、稳定的量子点[9]。尽管采用上述方法可以制备出高质量的量子点，然而，由于所使用的金属有机物稳定性较差，容易爆炸，用其作原料时极其危险，所需实验条件苛刻，限制了进一步的推广与应用研究。之后，Peng 等首次采用CdO 代替Cd(CH3)2，制备了性能优良的量子点[10]。实验结果表明，采用这种方法可以降低注射温度，合成重复性好，最重要的是CdO 即不自燃，也不爆炸，可以大量的使用反应原料。此后，他们又发现Cd(Ac)2、CdCO3 等镉的弱酸盐同样可以用作量子点合成的优良前体。由于以上试剂相对安全得多，反应不必在手套箱中进行，从而改进了实验条件，简化了实验操作。最近，Peng等将配位型溶剂TOPO换成非配位型溶剂十八烯（ODE），提出了非络合溶剂合成方法的概念，他们采用CdO和TOPSe（或者TBPSe）作为前体物质，硬脂酸（SA）作为配位物质，ODE作为溶剂，在高温下合成了性能优良的量子点，进一步加速了量子点制备工艺的研究进展。 但是，在有机体系中制备量子点，一般采用高温胶体化学合成方法，所用溶剂为TOPO或者ODE，这两种物质价格较高，并且需要大量使用，使得合成的成本居高不下，限制了其进一步的发展。针对这一问题，可采用工业用导热油Dowtherm RP替代上述溶剂，以CdO作为原料，直接制备了性能优良的CdSe量子点。该方法所用溶剂价格低廉，易于存储，为量子点的低成本合成提供了可能，有利于进一步的推广应用研究。紫外可见吸收光谱、荧光光谱、透射电子显微镜等方法表征的结果证明，产物的荧光性质好，均一性强，具有良好的单分散性和优异的光稳定性。通过控制反应时间，能够制备一系列粒径不等、发不同颜色荧光的量子点，可作为一种性能优良的荧光标记物，为进一步的应用研究奠定了基础。
3.1.1制备原理[11]